Chia sẻ Download
Tài liệu Ch­ương 1 LỊCH SỬ RA ĐỜI CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ
/138
Thành viên docx2013

Ch­ương 1 LỊCH SỬ RA ĐỜI CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ

- 12 tháng trước
1,037
Báo lỗi

 
1.1. ĐỊNH NGHĨA
            Theo F. Jacob thì sinh học hiện đại có mục đích là giải thích các đặc tính của cơ thể sống thông qua nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các phân tử vật chất thành phần.
            Sinh học phân tử là một ngành sinh học hiện đại quan tâm đến việc giải thích những hiện tượng và quy luật sinh học ở mức phân tử. Các nhà sinh học phân tử thường sử dụng những kỹ thuật hóa sinh để nghiên cứu những vấn đề di truyền. Lịch sử ra đời và phát triển của sinh học phân tử chính là sự hội tụ và phát triển của nhiều ngành khoa học khác nhau như­:  Sinh học tế bào, Di truyền học, Hóa sinh học và Vi sinh vật học. Có thể tóm tắt sự phát triển của ngành sinh vật học qua các giai đoạn chính sau đây:
 
1.2. THUYẾT TIẾN HÓA VÀ TẾ BÀO           
 
1.2.1. Thuyết tiến hóa của C. Darwin và A.R. Wallace
- Đề xuất vào năm 1859, xuất bản cuốn sách “Nguồn gốc các loài” (Origin of Species).
- Trên cơ sở quan sát giới tự nhiên về thành phần loài, đặc điểm và mối liên quan đến điều kiện sinh thái, địa lý.
- Sự phân bố địa lý của các loài sinh vật trên trái đất theo một quy luật nhất định tập trung thành các trung tâm khởi nguyên.
- Có sự khác và giống nhau giữa các nhóm loài sinh vật cận thân.
- Sinh vật thường xuyên biến đổi (qua thời gian dài) do chọn lọc tự nhiên thông qua những biến động của môi trường và chọn lọc nhân tạo bởi con người, giữ lại những đặc điểm thích ứng, sau đó được di truyền lại cho thế hệ sau, tạo lên sự đa dạng muôn hình muôn vẻ như hiện nay.
 
1.2.2. Thuyết tế bào
           -  Phát hiện ra tế bào bởi R. Hooke (1666).
            -  Nhờ sự phát minh ra kính hiển vi quan sát tế bào với độ phóng đại lớn, hình thành quan niệm là sinh vật đư­ợc cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào, có sinh vật đơn và đa bào.
-  Quan niệm về vật sống và vật không sống, trên cơ sở phân lập thành công tác nhân vi sinh vật gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm.  Phân biệt giữa bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm thì cần tiến hành theo phương pháp của Koch gồm các bước chính sau đây: phân lập được vi sinh vật gây bệnh, nuôi cấy trong môi trường tinh sạch, tái lây nhiễm và gây ra cùng triệu chứng bệnh, tái phân lập và thu được cùng tác nhân gây bệnh.  Trên cơ sở kết quả nuôi cấy hoặc bảo quản

Nội dung

Ch​ương 1

LỊCH SỬ RA ĐỜI CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ

1.1. ĐỊNH NGHĨA

Theo F. Jacob thì sinh học hiện đại có mục đích là giải thích các đặc tính của cơ thể sống thông qua nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các phân tử vật chất thành phần.

Sinh học phân tử là một ngành sinh học hiện đại quan tâm đến việc giải thích những hiện tượng và quy luật sinh học ở mức phân tử. Các nhà sinh học phân tử thường sử dụng những kỹ thuật hóa sinh để nghiên cứu những vấn đề di truyền. Lịch sử ra đời và phát triển của sinh học phân tử chính là sự hội tụ và phát triển của nhiều ngành khoa học khác nhau như​: Sinh học tế bào, Di truyền học, Hóa sinh học và Vi sinh vật học. Có thể tóm tắt sự phát triển của ngành sinh vật học qua các giai đoạn chính sau đây:

1.2. THUYẾT TIẾN HÓA VÀ TẾ BÀO

1.2.1. Thuyết tiến hóa của C. Darwin và A.R. Wallace

- Đề xuất vào năm 1859, xuất bản cuốn sách “Nguồn gốc các loài” (Origin of Species).

- Trên cơ sở quan sát giới tự nhiên về thành phần loài, đặc điểm và mối liên quan đến điều kiện sinh thái, địa lý.

- Sự phân bố địa lý của các loài sinh vật trên trái đất theo một quy luật nhất định tập trung thành các trung tâm khởi nguyên.

- Có sự khác và giống nhau giữa các nhóm loài sinh vật cận thân.

- Sinh vật thường xuyên biến đổi (qua thời gian dài) do chọn lọc tự nhiên thông qua những biến động của môi trường và chọn lọc nhân tạo bởi con người, giữ lại những đặc điểm thích ứng, sau đó được di truyền lại cho thế hệ sau, tạo lên sự đa dạng muôn hình muôn vẻ như hiện nay.

1.2.2. Thuyết tế bào

- Phát hiện ra tế bào bởi R. Hooke (1666).

- Nhờ sự phát minh ra kính hiển vi quan sát tế bào với độ phóng đại lớn, hình thành quan niệm là sinh vật đư​ợc cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào, có sinh vật đơn và đa bào.

- Quan niệm về vật sống và vật không sống, trên cơ sở phân lập thành công tác nhân vi sinh vật gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm. Phân biệt giữa bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm thì cần tiến hành theo phương pháp của Koch gồm các bước chính sau đây: phân lập được vi sinh vật gây bệnh, nuôi cấy trong môi trường tinh sạch, tái lây nhiễm và gây ra cùng triệu chứng bệnh, tái phân lập và thu được cùng tác nhân gây bệnh. Trên cơ sở kết quả nuôi cấy hoặc bảo quản trong điều kiện vô và hữu trùng, xuất hiện thối và không thối, hoặc có vi sinh vật hoặc không phân lập được vi sinh vật, L. Pasteur cho rằng sự sống chỉ có thể sinh ra từ sự sống.

- T.J. Schleiden (1838), T. Schwann (1839) cho rằng tế bào là đơn vị sống cơ bản ở cả động vật và thực vật, sau đó R. Virchow (1858) kết luận: mỗi động thực vật đều đư​ợc cấu tạo từ một tập hợp các đơn vị sống, mỗi đơn vị sống (tế bào) mang trong nó tất cả các đặc tính của sự sống.

- Tế bào cô lập có khả năng tái sinh, phân chia tế bào, phân hoá rồi sinh trưởng và phát triển thành một sinh vật hoàn chỉnh, đây là cơ sở của công nghệ nuôi cấy mô tế bào.

- Mỗi tế bào có một hình thù và kích thước nhất định, có cấu tạo bao gồm: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất bên trong chứa các cơ quan tử và nhân.

- Tất cả mọi sinh vật từ tiền nhân, đơn bào và đa bào đều xuất phát từ một tế bào ban đầu và mỗi tế bào dinh dưỡng của sinh vật nhân thật đều mang đầy đủ tất cả các thông tin di truyền của một cơ thể.

1.2.3. Quan niệm hiện đại về cấu trúc tế bào

Nhờ phát minh ra kính hiển vi điện tử có thể phóng đại tế bào hay mô của sinh vật quan sát lên hàng 1000 lần, nên đã:

- Phát hiện ra nhân, ty thể, lục lạp và các cơ quan tử khác của tế bào.

- Khả năng phá vỡ tế bào và thu được những cơ quan tử riêng biệt, từ đó có thể quan sát và nghiên cứu được chức năng của từng cơ quan tử riêng biệt.

- Sản phẩm protein của một số gen có thể có tác dụng điều hòa lên hoạt động của một số gen khác.

- Nuôi cấy thành công tế bào động vật có vú trong in vitro bởi H. Eagles và T. Puck.

- Ra đời của ngành virus học.

1.3. HÓA SINH HỌC VÀ DI TRUYỀN HỌC

- Hóa sinh học chuyên nghiên cứu thành phần hóa học của cơ thể sống, trao đổi chất và trao đổi năng lượng xảy ra trong cơ thể sống. Hiện người ta có thể cô lập và tổng hợp nhân tạo được một số thành phần của vật chất sống.

- Bệnh di truyền liên quan đến thiếu hụt hoặc thừa một hoặc vài chất hóa sinh.

- Thuyết một gen sinh ra một enzyme và sau này là một gen sinh ra một polypeptide.

- Phát hiện ra những đột biến liên quan đến hóa sinh (thiếu, thừa hoặc mất chất hóa sinh) và cơ chế các quá trình biến đổi vật chất xảy ra trong cơ thể sống.

- Di truyền học chuyên nghiên cứu di truyền các đặc tính của cơ thể sống.

- Từ phát minh của G. Mendel (1865-1900) bắt đầu có khái niệm về một số thuật ngữ như: Tính trạng, kiểu gen, kiểu hình, đồng hợp tử, alen, trội, lặn, nhiễm sắc thể, nguồn gen, quá trình tạo giao tử, phân chia nguyên nhiễm, giảm nhiễm, chuỗi gen liên kết, di truyền quần thể. Di truyền học có thể tóm tắt ở 4 khía cạnh sau:

+ Nghiên cứu về quá trình di truyền các tính trạng từ đời này qua đời khác.

+ Di truyền phân tử giải thích cấu trúc và chức năng của gen ở mức độ phân tử.

+ Di truyền quần thể nghiên cứu sự di truyền các tính trạng qua các nhóm cá thể, quần thể và loài.

+ Di truyền số lượng nghiên cứu sự di truyền những tính trạng được điều khiển bởi nhiều gen.

1.4. SỰ RA ĐỜI CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ

1.4.1. Lịch sử phát triển của sinh học phân tử

Lịch sử phát triển của sinh học phân tử là một quá trình phát triển liên tục của các phát minh trong sinh vật học, có thể điểm lại các mốc phát triển chính sau:

- Phát hiện ra cấu trúc DNA vào năm 1953, bởi J. Watson và F. Crick đã khởi đầu thời kỳ phát triển hiện đại của sinh học phân tử.

- Lý thuyết về codon bao gồm 3 nucleotide trên mRNA (triplet code) bởi G. Gamow năm 1954.

- Đưa ra khái niệm ciston của S. Benzer năm 1955.

- Khái niệm về operon và mRNA thông tin của F. Jacob và J. Monod năm 1957.

- Phát hiện ra (R) plasmid bởi K. Ochiai và M. Watanabe năm 1957.

- Khái niệm về một phân tử adaptor (tRNA) với một đối mã codon bởi F. Crick năm 1958.

- Phát hiện ra sự biến đổi nhiễm sắc thể của genome người và hội chứng Down của J. Lejeune, và hội chứng Turner bởi Ford năm 1959.

- Phát hiện ra quy luật phân chia nguyên nhiễm trong tế bào soma vào năm 1960 bởi Barski.

- Đột biến tại khung đọc mã di truyền ảnh hưởng đến thành phần codon vào năm 1960 bởi F. Crick và cộng sự.

- Năm 1961 phát hiện ra F plasmid bởi L.O. Driskell và K.I. Matthaei.

- Phát hiện ra khả năng lai DNA/DNA trong in vitro bởi J. Marmur vào năm 1963.

- Năm 1968 đã phát hiện ra enzyme cắt giới hạn bởi W. Arber, H.O. Smith và D. Nathan.

- Kỹ thuật nhuộm màu huỳnh quang và phẩm màu Giemsa để quan sát nhiễm sắc thể của sinh vật nhân chuẩn bởi T. Caspersson và cộng sự vào năm 1970.

- Kỹ thuật lai DNA/DNA và RNA/RNA in situ đề xuất bởi M.L. Pardue và G. Gall năm 1970.

- Kỹ thuật tái tổ hợp DNA trong ống nghiệm được đề xuất bởi R.O. Boyer và S.N. Cohen vào năm 1973.

- Tổng hợp gen nhân tạo bởi H.G. Khorana vào năm 1975.

- Kỹ thuật lai Southern bởi E. Southern vào năm 1975.

- Cấu trúc chi tiết của phân tử DNA, và xác định trình tự của chúng trong bộ genome bởi F. Sanger & A.R. Coulson và bởi A. Maxam & W. Gilbert vào năm 1977.

- Phát hiện ra các gen chồng lấp và đan xen nhau bởi F. Sanger vào năm 1978.

- Kỹ thuật PCR được phát minh bởi K. Mullis vào năm 1986.

1.4.2. Các mốc khám phá quan trọng

Trong đó đầu tiên phải kể đến công trình nghiên cứu chứng minh DNA là vật chất mang thông tin di truyền qua thí nghiệm trên vi khuẩn gây viêm phổi ở chuột của A. Hershey. Ông đã chứng minh rằng khi thực khuẩn thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn thì thực khuẩn thể chỉ chuyền DNA của mình vào tế bào vi khuẩn còn protein vỏ vẫn nằm ở bên ngoài. Sau đó chính DNA này sử dụng bộ máy sinh học của tế bào vi khuẩn để lại tổng hợp lên protein và thể thực khuẩn mới. Hiện nay khảng định rằng ở đâu có DNA thì ở đó có thể có mang thông tin di truyền quy định tạo nên các tính trạng.

1.4.3. Ba khám phá quan trọng vào những năm 1960

- mRNA truyền thông tin di truyền từ DNA (gen).

- Mã di truyền

- Protein được tạo ra từ thông tin di truyền của gen qua mRNA. Tổng hợp protein xảy ra ở tế bào chất, tại đây các amino acid được tRNA mang đầu đối mã với codon trên mRNA vận chuyển đến tại ribosome, lắp ghép với nhau, gọi là quá trình dịch mã.

- Vật chất sống, xem xét ở mức độ phân tử, đ​ược cấu tạo từ nhiều đại phân tử sinh học, trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein

1.4.4. Phát minh vào cuối những năm 1970

- Phát hiện ra các enzyme cắt giới hạn DNA.

- Nhân dòng những đoạn DNA được cắt nhờ vector trong tế bào vi khuẩn.

- Nhờ xác định được trình tự DNA, mà các nhà di truyền học có thể hiểu thấu vai trò của từng nucleotide trong một gen từ đó có thể tùy ý tạo ra những đột biến nhân tạo theo ý muốn.

- Chuyển gen mong muốn từ sinh vật này sang sinh vật khác tạo sinh vật chuyển gen.

1.5. NGUYÊN TẮC NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh học phân tử là một môn học của ngành sinh học, nên khi tiến hành nghiên cứu cần đảm bảo một số nguyên tắc chung sau.

- Khi đề xuất nội dung nghiên cứu cần phải đặt các câu hỏi tại sao phải nghiên cứu vấn đề này, nhằm giải quyết vấn đề gì, đã có bao nhiêu công trình nghiên cứu có liên quan được công bố trên cơ sở đó đề xuất nội dung cần nghiên cứu.

- Khi đặt các thí nghiệm nghiên cứu phải tuân thủ nguyên tắc sai khác duy nhất, có như vậy mới đánh giá đúng nguyên nhân và kết quả thu được, rồi mới đưa ra được những kết luận chính xác.

- Phải có quan điểm biện chứng, logic về tiến hóa luận, đối tượng nghiên cứu nằm ở đâu trong giới tiến hóa nào, các kết quả thu được có thể dùng để so sánh, đối chiếu với những hiện tượng tương ứng ở những nhóm sinh vật gần gũi tương tự không.

- Tế bào là một đơn vị sống, quy luật xẩy ra ở tế bào có thể suy đoán ra toàn mô và cơ thể sinh vật.

- Luôn có sự tương quan biện chứng giữa cấu trúc và chức năng biểu hiện ở mức tế bào, mô, cơ quan và cơ thể. Cần có cách nhìn biện chứng, tư duy logic, hiểu rõ và phân biệt được một chức năng nhất định là do cấu trúc nào sinh ra.

- Sinh vật chứa các vật chất vừa có đặc tinh sinh học vừa có cấu tạo vật lý và hóa học giống như giới vô sinh nên các quá trình sống cũng tuân thủ cả các quy luật vật lý và hóa học.

- Mọi quá trình sinh học xảy ra đều phải thu nhận hoặc thải ra năng lượng và vật liệu để chuyển hóa và tạo cấu trúc vật chất đặc thù mới, đồng thời có thể thải phế phẩm ra ngoài môi trường.

- Mọi quá trình sinh học xảy ra đều do thông tin di truyền tàng trữ trong DNA chi phối, hoạt động của gen đóng vai trò quyết định, môi trường đóng vai trò quan trọng.

- Nghiên cứu sinh học phải đặt tiến trình trong sự phát triển cá thể từ lúc sinh ra lớn lên trưởng thành già hóa rồi phải chết. Mỗi giai đoạn, thời kỳ có hoạt động sống riêng, luôn đổi mới và có quá trình trao đổi vật chất nhất định.

- Mỗi hiện tượng đều có thể có hai đặc điểm là mang tinh phổ biến hoặc đặc thù cần xác định rõ.

- Sinh vật có cơ chế phản hồi, khi sống trong môi trường chúng thường xuyên tiếp xúc, thu nhận các tín hiệu thông tin, xử lý và có phản ứng đáp lại. Khi một chất tổng hợp dư thừa sẽ ức chế hoạt tính của enzyme đầu quá trình tổng hợp ra nó.

- Các quá trình sinh học đều mang tính kế thừa, quá trình này là tiếp tục hay khởi đầu của quá trình kia đứng trên phương diện trao đổi và chuyển hóa vật chất.

1.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ

Chi tiết cụ thể các phương pháp sẽ được trình bầy trong phần 2 giáo trình “Sinh học phân tử“, có thể nêu ra một số phương pháp cơ bản sau:

- Phương pháp tế bào học, nuôi cấy mô, gây đột biến, phân lập và quan sát cấu trúc tế bào, cơ quan tử bằng kính hiển vi thường và điện tử, kết hợp với phân tích phân tử.

- Phương pháp phân tích các đại phân tử sinh học, tách chiết, điện di, sắc ký, định tính, định lượng, thử hoạt tính và xác định cấu trúc phân tử của các vật chất thành phần tạo ra chức năng.

- Kỹ thuật lai phân tử DNA, RNA và protein, các mẫu dò và phương pháp đánh dấu phân tử.

- Kỹ thuật di truyền tái tổ hợp DNA, protein, gây đột biến định hướng, nghiên cứu cơ chế phân tử của các quá trình, kết hợp giữa gây biểu hiện gen với phân tích phân tử.

- Phương pháp tổng hợp phân tử in vitro các phân tử thành phần, nghiên cứu chức năng riêng lẻ và trong một thể thống nhất hài hòa của cơ thể sống.

- Hệ thống vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử.

- Ứng dụng tin sinh học trong nghiên cứu, mô tả, so sánh cấu trúc và chức năng các phân tử thành phần sinh vật.

1.7. NỘI DUNG MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ ĐẠI CƯƠNG

Sinh học phân tử đại cương gồm 8 chương, với nội dung từng chương được tóm tắt dưới đây:

- Các đại phân tử sinh học, cấu tạo và chức năng.

- Liên kết hóa học yếu và vai trò trong hệ thống sống

- Gen và genome, cấu trúc và chức năng ở các thể sinh vật và cơ quan tử trong tế bào.

- Tính ổn định của DNA, quá trình tái bản bán bảo toàn và cơ chế sửa sai ở hai hệ thống sinh vật (prokaryote và eukaryote).

- Cơ chế gây biến đổi DNA, cơ chế phân tử của đột biến gen và nguyên nhân. Biến đổi DNA xẩy ra ở 2 hệ thống sinh vật. Tái tổ hợp DNA ở vi sinh vật và trao đổi chéo nhiễm sắc thể ở sinh vật nhân thật.

- Phiên mã sinh tổng hợp RNA, cơ chế phân tử của quá trình. Quá trình phiên mã ở hai hệ thống sinh vật.

- Mã di truyền và dịch mã, cơ chế phân tử và vai trò các loại RNA trong quá trình tổng hợp protein.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Nêu tóm tắt thuyết tiến hoá của C. Darwin và A.R. Wallace, nguyên nhân dẫn đến sự đa hình của các loài về tính trạng và phân tử hiện nay.

2. Nêu tóm tắt nội dung thuyết tế bào, mô tả một thí dụ chứng minh sự sống chỉ có thể sinh ra từ sự sống.

3. Quan niệm về vật sống và không sống nêu đặc tính của vật sống. Nêu nguyên tắc xác định bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm.

4. Nêu và giải thích một số khái niệm: tính trạng, kiểu gen, kiểu hình, đồng hợp tử, alen, trội, lặn, nhiễm sắc thể, nguồn gen, quá trình tạo giao tử, phân chia nguyên nhiễm, giảm nhiễm, chuỗi gen liên kết, di truyền quần thể

5. Điểm lại những mốc phát triển quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của sinh học phân tử hiện đại.

6. Nêu và phân tích các nguyên tắc và tư duy trong nghiên cứu sinh học phân tử.

Chương 2

ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC

Giới sinh vật rất đa dạng và phong phú, tồn tại ở khắp mọi nơi trên trái đất, song thành phần cấu tạo cơ bản lên chúng là các đại phân tử và tiểu phân tử hữu cơ sinh học. Trong đó nucleic acid và protein là hai đại phân tử đóng vai trò quyết định của mọi cấu trúc, chức năng sinh vật. Trong chương này chúng ta sẽ tập trung nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các đại phân tử .

2.1. NỘI DUNG VÀ NHIỆM VỤ

- Nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính và chức năng của các đại phân tử sinh học như DNA, RNA, protein, các loại đường, tinh bột, chất béo, các chất thơm... là những thành phần không thể thiếu được trong cơ thể sống.

- Đặc điểm chung của các đại phân tử là chúng thường được hình thành từ những phân tử nhỏ cùng loại (monomer) liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị như protein, nucleic acid, polysacharide.

- Các đại phân tử có khối lượng phân tử lớn, phổ biến, có mặt trong mọi tế bào và cơ thể sống, đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống của cơ thể.

- Mỗi phân tử có một chức năng nhất định và sự tương tác giữa các phân tử sinh học với nhau sẽ quy định vai trò của từng thành phần trong một tổng thể thống nhất, hài hòa của một cơ thể sống.

- Trong cơ thể các đại phân tử thường xuyên biến đổi, tổng hợp lại mới từ những tiểu phân tử, phân giải thành các tiểu phân tử, vận chuyển đến cơ quan khác, rồi có thể lại được tổng hợp mới lại.

- Hiện nay người ta đã phát hiện được rất nhiều chất thứ cấp sinh học khác nhau, đã biết cấu tạo hóa học, quá trình tổng hợp, loài sinh vật nào sinh ra, chức năng sinh học trong sinh vật, vai trò đối với người và động vật, thậm trí còn nghiên cứu cả các phương pháp tách chiết, tinh chế và làm tăng hoạt tính của chúng.

Những phân tử trong tế bào được chia thành 2 nhóm:

- Kích thước phân tử nhỏ như đường đơn, amino acid, acid béo... có khoảng 750 loại phân tử nhỏ khác nhau tìm thấy trong tế bào sinh vật.

- Nhóm đại phân tử trong đó nucleic acid, chất mang thông tin di truyền và protein, sản phẩm được hình thành từ thông tin di truyền có vai trò quan trọng nhất. Hiện các nhà khoa học phán đoán đang tồn tại hơn 200 loại đại phân tử.

- Hai nhóm phân tử chúng khác nhau bởi khối lượng phân tử, mức độ phức tạp trong cấu trúc, đóng vai trò trong hoạt động sống của tế bào sinh vật và tính đa hình của chúng

Nhờ phản ứng hóa sinh xúc tác bởi enzyme chúng ta có thể:

- Cắt nhỏ các đại phân tử thành các tiểu phân tử tách rời, được vận chuyển rồi sau đó có thể lắp ghép lại để tạo thành một đại phân tử mới.

- Quá trình phản ứng giải phóng ra năng lượng hoặc cần năng lượng để tạo ra những phân tử mới có năng lượng cao hơn nhiều.

- Tổng hợp lên các phân tử nhỏ làm thành phần của các đại phân tử trong tế bào.

- Lắp ghép các tiểu phân tử đơn thành các đại phân tử mong muốn theo nhu cầu và tùy theo giai đoạn sinh trưởng, phát triển của tế bào, mô và cơ thể sinh vật.

2.2. NUCLEIC ACID

2.2.1. Những phát hiện về gen và DNA trước Watson và Crick

- Theo G. Mendel, coi gen là nhân tố di truyền quy định những tính trạng đặc thù, nhưng bản chất như thế nào thì vẫn chưa rõ. Tương tự như vậy, đột biến làm thay đổi chức năng của gen nhưng chính xác là do cơ chế nào thì không rõ.

- Thuyết một gen - một protein đã mô hình hoá việc một gen quy định cấu trúc của một protein.

- Gen được phát hiện nằm trên các nhiễm sắc thể.

- Nhiễm sắc thể chứa DNA và protein (các histone).

- Hàng loạt các công trình nghiên cứu vào những năm 1920, chứng minh DNA là vật chất mang thông tin di truyền.

- Thí nghiệm phát hiện hiện tượng biến nạp (transformation) của phế cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi ở người và làm cho chuột chết do Frederick Griffith, người Anh, tiến hành vào năm 1928. Để hiểu được thí nghiệm này chúng ta cần biết là vi sinh vật thường tồn tại nhiều chủng khác nhau trong một vùng sinh thái, một vết bệnh hay trong một tế bào hay mô của ký chủ. Muốn tách riêng từng chủng thì người ta thường dùng phương pháp pha loãng dịch chiết tách chứa vi khuẩn gây bệnh thành đơn tế bào, sau đó nuôi cấy dòng tế bào trên môi trường đặc agar sẽ được các khuẩn lạc, gọi là các chủng phân lập. Để xác định chúng phân lập thuộc nhóm chủng nào có thể có nhiều phương pháp khác nhau như dựa vào cấu trúc hình thái tế bào vi khuẩn, màu sắc và hình dạng khuẩn lạc, hoặc bằng phản ứng sinh hóa hay kỹ thuật phân tích DNA. Trường hợp thí nghiệm đối với phế cầu khuẩn gây viêm phổi chuột có thể tóm tắt như sau: phế cầu khuẩn có 2 dạng S và R, dạng S có vỏ bao tế bào bằng pol‎ysaccharit cản trở bạch cầu phá vỡ tế bào vi khuẩn, nên gây chuột chết, còn dạng R do không có vỏ bao, bị bạch cầu tiêu diệt nên không gây bệnh. Dạng S khi được nuôi cấy sẽ cho khuẩn lạc nhẵn, còn dạng R cho khuẩn lạc ráp. Thí nghiệm tiến hành như sau:

+ Tiêm vi khuẩn S sống gây bệnh cho chuột thì chuột chết.

+ Tiêm vi khuẩn R sống không gây bệnh cho thì chuột sống.

+ Tiêm vi khuẩn S bị đun chết cho chuột thì chuột sống.

+ Tiêm hỗn hợp vi khuẩn S bị đun chết với R sống cho chuột thì chuột chết. Trong xác chuột chết tìm thấy có cả vi khuẩn S và R. Kết quả trên chứng tỏ có thể do một nhân tố nào đó của chủng S đã truyền sang chủng R và nhờ protein còn sống của R hoạt hoá tạo ra thể vi khuẩn S và gây bệnh làm chuột chết.

- Năm 1944, Oswald Avery và 2 đồng nghiệp khác là Colin MacLeod và Maclyn McCarty đã xác định tác nhân gây biến nạp chính là DNA vì sau khi xử lí vi khuẩn S sống bằng protease, enzyme phân huỷ protein, hoặc bằng RNase, enzyme phân huỷ RNA thì khả năng biến nạp vẫn còn. Nhưng nếu xử lí bằng DNase, enzyme phân huỷ DNA thì hoạt tính biến nạp không còn, chứng tỏ DNA chính là nhân tố gây biến nạp.

- Thí nghiệm nghiên cứu sự xâm nhiễm của DNA thực khuẩn thể (bacteriophage) vào tế bào vi khuẩn thông qua phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ S35 và P32 của Alfred Hershey và Martha Chase tiến hành vào năm 1952 chứng minh khi thực khuẩn thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn thì chỉ có DNA được đưa vào trong tế bào vi khuẩn còn protein của thực khuẩn thể vẫn nằm bên ngoài tế bào vi khuẩn. Ngày nay người ta đã khẳng định ở đâu có DNA (một ít trường hợp là RNA) thì ở đó chứa gen mang thông tin di truyền qui định và có thể tạo thành tính trạng.

2.2.2. Cấu trúc DNA

a. Đặc tính của vật chất di truyền

Trước khi phát hiện ra cấu trúc DNA, thì đã có nhiều tranh cãi về vật chất di truyền là protein, acid nhân hay một chất nào khác. Cuối cùng đều thống nhất là vật chất di truyền cần phải có đầy đủ 3 đặc tính cơ bản sau:

- Mọi tế bào soma trong một cơ thể sinh vật cần phải có cùng một cấu trúc di truyền, vật chất di truyền phải được tái bản một cách chính xác qua mỗi lần phân chia tế bào.

- Vật chất di truyền phải tàng chứa những thông tin di truyền quy định việc tạo ra các protein có chức năng xúc tác cho quá trình hình thành tính trạng.

- Phải có khả năng đột biến và di truyền lại cho đời sau làm cơ sở cho tiến hoá sinh vật.

Ngoài các đặc tính trên DNA còn có tiềm năng tự sửa sai để bảo toàn tính nguyên vẹn.

b. Cấu trúc DNA theo Watson và Crick

- Thành phần hoá học

DNA là phân tử trùng phân, mạch thẳng không phân nhánh, bao gồm 2 mạch đơn, mỗi mạch đơn hình thành do liên kết trùng phân giữa 4 nucleotide tạo nên chuỗi phân tử dài hàng trăm, hàng ngàn thậm chí hàng triệu nucleotide.

Các đồng phân của Purine

Mỗi nucleotide bao gồm:

+ Đường 2’ deoxyribose, là đường pentose chứa 5 nguyên tử cacbon và cacbon ở vị trí số 2’ chứa nhóm H thay bằng nhóm OH của đường ribose trong RNA .

+ Bazơ nitơ có 4 loại là A, T, C và G, chia thành 2 nhóm là bazơ purine (bazơ to có 2 vòng thơm) gồm Adenine và Guanine, còn nhóm pyrimidine (bazơ nhỏ chứa 1 vòng thơm) gồm Thymine và Cytosine. Liên kết giữa cacbon số 1 của đường pentose với nitơ số 1 của bazơ nhóm pyrimidine hoặc nitơ số 9 của bazơ purine sẽ tạo thành một nucleoside.

+ Ngoài ra trong thành phần còn một số bazơ hiếm đồng phân với 4 bazơ phổ biến cũng có thể được nhập vào phân tử DNA do những điều kiện nhất định.

+ Nucleoside gồm đường liên kết với bazơ nitơ, khi thêm gốc phosphate sẽ thành nucleotide. Trong tế bào chứa cả 3 loại là dNMP, dNDP và dNTP nhưng chỉ dNTP là được sử dụng để tổng hợp DNA. Tên đầy đủ của 4 dNTP là: 2’-deoxyadenosine 5’-triphosphate, 2’-deoxycytidine 5’-triphosphate, 2’-deoxyguanosine 5’-triphosphate, 2’-deoxythymidine 5’-triphosphate.

+ Nhóm phosphate có thể gồm 1, 2 hoặc 3 gốc phosphate gắn vào vị trí cacbon số 5 của đường, theo thứ tự lần lượt là α, β và γ.

+ Chuỗi polynucleotide được tạo thành do các nucleotide liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester giữa nhóm OH của bazơ trước với gốc phosphate ở vị trí cacbon số 5 của nucleotide tiếp theo tạo thành, quá trình này liên quan đến việc loại bỏ 2 gốc phosphate bên ngoài (β và γ) của nucleotide tiếp theo. Hai đầu của chuỗi polynucleotide có cấu tạo hoá học xác định, đầu 5’ chứa 1 hoặc 3 gốc phosphate (5’-P terminus) không hoạt động, còn đầu kia 3’ (cacbon số 3) chứa nhóm OH. Điều này có nghĩa rằng phân tử DNA có hướng hoá học 5’→3’ hoặc 3’→5’, nhưng hướng tổng hợp của tất cả các DNA polymerase đều theo chiều 5’→3’.

Quy tắc Chargaff về thành phần các nucleotide trong một phân tử DNA

+ Tổng số phân tử pyrimidine (T + C) luôn bằng tổng số phân tử purine (A + G).

+ Số phân tử nucleotide T luôn luôn bằng số phân tử nucleotide A và số phân tử nucleotide C luôn luôn bằng số phân tử nucleotide G. Nhưng tổng số nucleotide A + T không cần thiết phải bằng C + G. Tỷ số này biến động theo loài sinh vật nhưng giống nhau ở các mô khác nhau trong cùng một cơ thể sinh vật.

Hình 2 - 1. Cấu trúc hóa học và chuỗi xoắn kép phân tử DNA

Chuỗi xoắn kép DNA

+ DNA là một đại phân tử gồm 2 chuỗi polynucleotide đơn xoắn vào nhau (dsDNA). Watson và Crick năm 1953 đã phát minh ra cấu trúc này. Mỗi mạch có các cặp bazơ đối xứng nhau theo quy luật A luôn liên kết với T bằng 2 liên kết hydro, còn C luôn liên kết với G bằng 3 liên kết hydro. Các nucleotide của 2 mạch luôn luôn đối xứng nhau. Một đặc tính nữa của chuỗi xoắn kép DNA sự tương tác liên kết hyđro giữa các cặp bazơ lân cận làm cho phân tử DNA khi ở trạng thái xoắn kép sẽ bền vững hơn. Hướng xoắn của 2 mạch đơn ngược chiều nhau nên gọi chúng là hai mạch đối xứng song song. Mỗi mạch đơn (ssDNA) mang trình tự các bazơ khác nhau, cho nên mỗi mạch mang thông tin di truyền khác so với mạch kia. Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung trên 2 mạch, do vậy quá trình tự sao chép sẽ tuân thủ theo nguyên tắc bán bảo thủ.

+ Khi viết trình tự một phân tử DNA, người ta thường chỉ viết trình tự một sợi đơn hướng 5' – 3', đầu 5' ở bên trái còn đầu 3' ở bên phải.

+ Chiều dài phân tử DNA được đo bằng số cặp bazơ (bp, Kb và Mb).

c. Đặc tính của DNA

- Đặc tính biến tính là khả năng sợi kép DNA trong điều kiện nhiệt độ cao gần điểm sôi hoặc pH < 3 hay trên 10 có thể sẽ tách rời thành 2 sợi đơn và ngược lại, nếu điều kiện trên quay lại trạng thái ban đầu một cách từ từ thì 2 sợi đơn này lại có thể ghép bổ sung thành sợi kép ban đầu. Người ta lợi dụng đặc tính này trong phương pháp lai DNA và PCR.

- DNA mang điện âm còn những protein histone lại tích điện dương, làm trung hòa điện tích của DNA trong nhiễm sắc thể.

- DNA nằm chủ yếu ở trong nhân tế bào, trong nhiễm sắc thể chiếm đến 98 - 99%, mỗi nhiễm sắc thể có chứa một sợi DNA, ngoài ra còn nằm ở ty thể, lạp thể, virus, viroid gây bệnh hoặc vi sinh vật khác sống ký sinh trong tế bào như vi khuẩn wolbachia sống trong tế bào sinh sản của côn trùng chân đốt có tác dụng làm thay đổi giới tính.

- DNA của sinh vật nhân thật có cấu tạo dạng thẳng, còn của sinh vật tiền nhân có cấu tạo dạng vòng (vi khuẩn, virus), tuy nhiên chúng đều cuộn chặt thành một phức hợp gọi là nhiễm sắc thể.

- DNA thường có kích thước rất lớn ví dụ ở người có sợi DNA có thể dài đến 1mm, như vậy nó phải nén chặt tùy theo mức độ, thấp là ở thể nucleosome và cao là nhiễm sắc thể. Sợi nhiễm sắc có kích thước khoảng 100Ao nhiều khi đạt tới 300Ao, trong khi đường kính DNA chỉ đạt 20Ao.

- Sợi có đường kính 100Ao là chuỗi gồm nhiều nucleosome, một nucleosome chứa một sợi DNA quấn quanh một lõi gồm 8 phân tử histone. Các sợi 100Ao lại tổ chức thành một cấu trúc phức tạp và lớn hơn có đường kính 300Ao gọi là các solenoid.

- Trong nhân tế bào, các sợi solenoid kết hợp chặt chẽ với nhiều protein và cả RNA tạo thành nhiễm sắc chất, khi đạt độ nén cực đại sẽ tạo thành nhiễm sắc thể.

- Chu kỳ sống của tế bào gồm 4 pha:

+ G1: Chuẩn bị cho quá trình sinh tổng hợp DNA

+ S: Tổng hợp DNA và histone

+ G2: chuẩn bị phân đôi

+ M: phân chia (4 kỳ). Chu kỳ ngừng phân chia tiếp tục, tế bào bước vào Go hoặc chuyển sang giai đoạn phân hoá.

- Kích thước DNA của eukaryote hoàn toàn không có mối liên quan gì đến kích thước và mức độ tiến hoá của sinh vật. Thí dụ ở một số thực vật và động vật lưỡng thê, genome của chúng có thể có kích thước DNA lớn gấp trăm lần ở người.

- Toàn bộ DNA của gen sinh vật tiền nhân đều mang thông tin di truyền mã hóa cho các protein, còn DNA gen của sinh vật nhân thật gồm các trình tự mã hóa exon và không mã hóa intron xen kẽ nhau. Ở người, bộ genome nhân chứa 3.109bp trong đó chứa từ 30.000 – 40.000 gen với tổng lượng DNA chỉ chiếm 5% genome.

- Cấu trúc DNA trong genome gồm:

+ Trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10 - 15% bộ gen động vật có vú. Đây là những trình tự ngắn (10 - 200 kb) không mã hóa nằm ở tâm động và đầu các nhiễm sắc thể (vị trí telomere), chức năng chưa rõ, nhưng tham gia vào quá trình di chuyển sợi nhiễm sắc tử khi phân chia tế bào.

+ Trình tự lặp lại trung bình chiếm từ 25 - 40%, trong bộ gen người, kích thước từ 100 - 1000 kb, đa dạng hơn và không tập trung ở tâm động và telomere mà nằm rải rác trong genome, có thể không và gồm cả trình tự mã hóa chủ yếu tạo thành rRNA, tRNA và RNA 5S.

+ Trình tự duy nhất là các gen mã hóa các protein đặc trưng cho từng gen.

2.2.3. RNA

Điểm khác biệt với DNA

Cấu trúc RNA có bốn điểm khác so với DNA là:

- RNA thường là một chuỗi nucleotide mạch đơn, không xoắn kép như DNA. Do vậy RNA dễ linh động hơn và có thể hình thành được nhiều hình dạng phân tử có không gian 3 chiều. Nó có thể gập lại nhờ ghép cặp giữa các bazơ bổ sung với nhau tạo lên những hình thể nhất định.

- RNA chứa đường ribose trong các nucleotide, đường này khác đường deoxyribose ở nhóm H thay bằng OH tại vị trí carbon số 2.

- Nucleotide của RNA gồm A, G và C, còn thymine được thay bằng uracine. Uracil có khả năng ghép cặp với G và A, và U với G chỉ ghép cặp được khi nó cuộn lại chứ không ghép cặp khi phiên mã, 2 liên kết hydro giữa U và G này yếu hơn giữa U và A. Khả năng ghép cặp giữa U và G đã giúp RNA tạo được những cấu trúc phức tạp, đóng vai trò quan trọng trong một số quá trình sinh học.

- RNA có đặc tính giống với protein chứ không giống DNA là có thể xúc tác cho những phản ứng sinh học, vì thế có thể gọi là ribozyme.

Có ba loại RNA là mRNA, tRNA và rRNA.

mRNA

- Là bản sao của DNA, đối mã với sợi đơn hướng 3’- 5’ của DNA gen. Đóng vai trò trung gian chuyển thông tin mã hóa từ phân tử DNA đến bộ máy giải mã thành protein.

- Các mRNA có cấu trúc đa dạng thường ngắn hơn đoạn gen DNA mà nó được mã hóa, mỗi mRNA gồm thêm một hoặc vài protein. Tuỳ mỗi lượng, mRNA thường chiếm khoảng 2 - 5% tổng RNA trong tế bào.

- Sơ đồ mối quan hệ giữa DNA và RNA như sau:

Sao chép (DNA) ( Phiên mã (RNA) ( Dịch mã (Protein).

- Các mRNA của sinh vật nhân chuẩn thường có đầu 3’ là polyA, đuôi này đính vào mạch ngay sau khi tổng hợp xong mRNA, còn đầu 5’ đính 7 methyl - Gppp, mũ này đính vào mạch mRNA trong quá trình tổng hợp, có vai trò điều khiển quá trình dịch mã chính xác từ codon khởi đầu AUG qua ribosome.

- mRNA của sinh vật nhân thật thường được sinh ra từ một gen phiên mã trong nhân, sau khi thành thục sẽ chuyển ra tế bào chất. mRNA của sinh vật tiền nhân thường là một chuỗi phiên mã của nhiều gen ví dụ như các gen cấu trúc của Lac operon.

RNA chức năng

- RNA vận chuyển (tRNA)

+ Vận chuyển chính xác amino acid đến mRNA trong quá trình dịch mã tạo protein.

+ Cấu trúc dưới dạng 3 chạc, ổn định nhờ một số đoạn có liên kết bổ sung.

+ Có hai vị trí không có liên kết bổ sung, một là anticodon (bộ 3 nucleotide bổ sung với bộ 3 nucleotide codon của mRNA), còn đầu kia có trình tự CCA nối cộng hóa trị với một amino acid tương ứng.

- Các RNA của ribosome(rRNA)

+ Là thành phần chính của ribosome, giúp mRNA và tRNA kết gắn các amino acid tạo thành chuỗi protein.

+ Chiếm 80% tổng RNA của tế bào nằm chủ yếu ở tế bào chất.

+ Các rRNA kết hợp với các protein chuyên biệt tạo thành các ribosome.

+ Tùy theo hệ số lắng S, mà rRNA của sinh vật nhân thật chia thành nhiều loại: 28S, 18S, 5,8S và 5S.

+ rRNA của mọi tế bào đều gồm một tiều phần lớn và một tiểu phần nhỏ khác nhau bởi mang nhiều hay ít protein và kích thước hai rRNA cấu thành cũng khác nhau.

+ Nhiều rRNA còn có chức năng xúc tác như một protein enzyme.

+ rRNA được trưởng thành từ một phân tử tiền thân, thường cần xúc tác của enzyme, trường hợp không cần xúc tác thì có trình tự intron trong nội phân tử RNA sẽ tự xúc tác cho quá trình đó.

+ Gần đây nhóm RNA xúc tác được phát hiện trong quá trình trưởng thành của tRNA và chu kỳ sống của một số viroid thực vật.

- Viroid là một nhân tố gây bệnh thực vật, có cấu tạo gồm những phân tử RNA sợi đơn, dài từ 270 đến 380 nucleotide nhỏ hơn hàng ngàn lần so với loại virus nhỏ bé nhất, nó không có vỏ protein, không trải qua giai đoạn DNA trong chu kỳ sống, tái bản trực tiếp tạo RNA và không kết gắn vào genome của ký chủ, gây bệnh nhờ có chứa đoạn bổ sung với 7S RNA của ký chủ, tác dụng như một antigen RNA ngăn cản việc hình thành và tạo ra chức năng của cấu tử nhận biết tín hiệu, làm rụt đỉnh sinh trưởng, ví dụ như viroid cà chua.

- Trong nhân, RNA tập trung thành một số hạt đậm đặc đính vào các nhiễm sắc thể.

+ Ribosome là những hạt Ribonucleoprotein có đường kính từ 10 - 20(m, là nơi dịch mã. Ribosome gồm hai cấu tử (subumit) kích thước không bằng nhau, được ràng buộc với nhau bằng ion Mg2+, mỗi cấu tử được tạo bởi những phần tương ứng nhau của RNA và protein. Mỗi cấu tử ribosome được lắp ghép bởi một phân tử RNA liên kết với 20 –30 protein có khối lượng phân tử nhỏ để hình thành một khối cuộn chắc.

+ Ở sinh vật nhân thật, các RNA ribosome trong tế bào chất được tạo ra từ các cistron (các đoạn DNA tạo ra RNA) nằm ở vùng nhiễm sắc thể gắn giầu RNA. Ít nhất có bốn loại ribosome khác nhau bởi hệ số lắng. Ở Ribosome động vật có chứa hai tiểu cấu tử là 5,8S liên kết hydro với 28S, cả hai cùng được sinh ra từ tiểu cấu tử 28S ban đầu.

+ Gen mã hóa sinh ra RNA ribosome nằm trong những đơn vị lặp lại kế tiếp nhau ở vùng nhiễm sắc thể gắn giầu RNA. Mỗi đơn vị cách nhau bởi một khoảng cách, phần này không phiên mã và chứa ba cistron mã hóa tạo thành ba ribosome là: 18S, 5,8S và 28S theo thứ tự đoạn này từ đầu 5’ là 18S đến 5,8S rồi đến 28S ở đầu 3’. Những gen tạo RNA được ký hiệu là rDNA.

+ Nucleolus organizer (tổ chức nucleolus) là một thể hình cầu, giàu RNA, ở cây ngô thể này nằm cạnh và đính vào nhiễm sắc thể số 6, thể này xuất hiện ở tiền kỳ, và chứa những gen tổng hợp RNA ribosome.

+ Nucleolus được hợp thành bởi sản phẩm ban đầu của những gen tạo ribosome, một số protein và nhiều enzyme như RNA polymerase, RNA methylase và RNA endonuclease.

- Các RNA nhỏ ở trong nhân (small nuclear RNAs, snRNA), là thành phần của hệ thống tham gia vào quá trình phiên mã ở sinh vật nhân chuẩn.

+ Một số snRNA kết hợp với cấu tử protein để hình thành nên ribonucleoprotein như spliceosome có nhiệm vụ cắt bỏ các intron ra khỏi mRNA. Nhiều gen trong genome phiên mã tạo ra RNA chức năng tham gia vào quá trình điều hoà mức độ hoạt động của gen

+ Các tiểu RNA (MicroRNAs, miRNA), được tổng hợp bởi nhiều gen trong genome, có vai trò lớn trong việc điều hoà hàm lượng protein từ nhiều gen trong sinh vật nhân thật.

+ RNA nhỏ can thiệp (small interfering RNAs), giúp thực, động vật bảo vệ tính toàn vẹn của genome, bằng cách ức chế sự sinh sản và xâm nhập của virus, ngăn ngừa sự di chuyển của những yếu tố di động đến vị trí locus khác trên nhiễm sắc thể.��

2.3. PROTEIN

2.3.1. Cấu trúc, thành phần

- Đơn vị cơ bản tạo nên cấu trúc protein là amino acid, giới sinh vật có khoảng 20 amino acid, với công thức gồm các amino acid liên kết vơí nhau bằng liên kết peptide.

Liên kết peptide là sự kết hợp giữa nhóm amine của một amino acid với nhóm carboxyl của amino acid kế tiếp. Phản ứng kết hợp này tạo thành một liên kết peptide và giải phóng ra một phân tử nước. Peptide là một phức hợp được tạo thành từ 2 đến 30 amino acid, còn nếu dài hơn thì gọi là polypeptide.

- Cấu tạo hóa học của 20 amino acid, các gốc R và chữ viết tắt.

- Có 4 nhóm amino acid:

+ Nhóm kiềm, ở pH tế bào, gốc amin ở nhánh bên bị ion hóa thành NH3+ mang điện tích dương.

+ Nhóm acid, ở pH tế bào, gốc COOH nhánh bên bị ion hoá sẽ mang điện tích âm COO -.

+ Nhóm trung tính kỵ nước ở nhánh bên sẽ không mang điện tích.

+ Nhóm trung tính phân cực thì nhánh bên thường mang nhóm OH.

Tất cả các chuỗi polypeptide đều có 2 amino acid ở 2 đầu tận cùng một đính nhóm amin, còn đầu kia đính gốc COOH tự do và được tổng hợp từ trái sang phải, bắt đầu từ a.amin chứa đầu amin và kết thúc là a.amin chứa đầu cacboxin.

Các protein khác nhau có trình tự và thành phần các amino acid khác nhau, trình tự và thành phần các amino acid quyết định tính chất và chất lượng của protein.

- Protein chỉ một đơn vị chức năng gồm không chỉ trình tự các amino acid trong chuỗi mà còn bao gồm cả cấu trúc không gian phức tạp, một protein có thể được tạo thành từ nhiều polypeptide. Có bốn kiểu cấu trúc protein (4 bậc):

+ Cấu trúc bậc một là trình tự sắp xếp của các amino acid trong chuỗi protein, có 20 a.amin cấu tạo nên protein. Các amino acid đều có 3 nhóm gốc giống nhau là amin (-NH2), cacboxin(-COOH) và hydro (-H) còn gốc R thì khác nhau và quy định tính chất khác biệt giữa các amino acid. Liên kết peptide (-CO-NH-) là liên kết đồng hoá trị hình thành giữa nhóm amin của amino acid này với nhóm cacboxin của amino acid bên cạnh. Phản ứng trùng hợp thường được gọi là phản ứng trùng hợp mất nước.

Cấu trúc bậc một quy định tính đặc thù của phân tử protein, đồng thời còn quy định cấu trúc không gian của phân tử protein. Nếu chuỗi protein bị mất, thừa hoặc thay đổi trình tự dù chỉ một amino acid cũng sẽ dẫn đến sự thay đổi tính đặc thù và tính chất của protein.

Trong chuỗi polypeptide có chứa các amino acid đặc thù, quy định vùng hoạt động chức năng đặc thù của protein như enzyme, trung tâm nhận biết các phân tử khác, vùng liên kết với DNA, vùng chứa địa chỉ nơi mà protein sẽ được vận chuyển đến các cơ quan tử như: ty thể, lạp thể, ribosome, nhân, màng sinh chất hoặc xuất ra ngoài tế bào.

+ Cấu trúc bậc hai là sự uốn các phần của từng chuỗi thành cấu trúc đều đặn trong không gian theo kiểu dạng xoắn ( hay phiến gấp nếp (. Liên kết hydro đóng vai trò quan trọng tạo nên cấu trúc bậc hai. Những yếu tố nào ảnh hưởng đến cấu trúc bậc hai thì đều ảnh hưởng đến hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc bậc hai là dạng trung gian chuyển tiếp để phân tử protein hình thành nên cấu trúc bậc ba phức tạp hơn.

+ Cấu trúc bậc ba được hình thành do các chuỗi polypeptíde cuộn xoắn hay gấp khúc tạo nên phân tử có cấu hình không gian ba chiều, cấu hình 3D của protein. Cấu hình 3D cũng quy định hoạt tính, chức năng của protein. Cấu trúc 3D được tạo nên bởi các liên kết yếu như liên kết ion, liên kết kỵ nước, hoặc liên kết disulphit giữa 2 amino acid chứa lưu huỳnh. Khi có tác động của nhiệt độ, pH, hoặc hoá chất độc sẽ dẫn đến làm thay đổi hình thù 3D gọi là quá trình gây biến tính protein sẽ dẫn đến việc huỷ hoại chức năng, thậm trí tạo nên trạng thái gây bệnh. Ví dụ điển hình là một protein có tên là prion, đây là loại protein gây nhiễm bệnh làm cừu, dê và bò điên. Trước kia người ta lầm tưởng bệnh này do virus chậm hoặc viroid gây nên. Nguồn gốc sinh ra prion là do gen mã hoá protein lành bị đột biến làm thay đổi cấu trúc 3D, bình thường gồm 3 chuỗi xoắn ( và 2 chuỗi (, nhưng khi bị biến đổi một chuỗi ( biến thành chuỗi (, chúng bị biến đổi cấu hình tạo thành prion gây bệnh. Ở trạng thái prion gây bệnh chúng chống chịu được với các enzyme phân giải và tác nhân tiệt trùng, hơn nữa chúng còn có thể làm các prion lành khác thành các prion gây bệnh vì thế chúng trở thành phân tử protein truyền bệnh.

+ Cấu trúc bậc bốn được hình thành do 2 hoặc nhiều chuỗi polypeptide thành phần tương tác với nhau tạo nên.

- Hầu hết các protein chỉ chứa một chuỗi polypeptide, một số ít khác như hemoglobin chứa tới 4 polypeptide, 2 chuỗi trình tự đặc thù ( và 2 chuỗi trình tự (. Thành phần một polypeptide có thể chứa từ 5 đến 4000 amino acid. Trong tế bào, protein luôn được tổng hợp, phân giải và thay thế. Tất cả các protein đều được tổng hợp trên ribosome theo mã bộ 3 nu trên mRNA. Khi protein không còn được sử dụng hoặc bị sai lệch chúng sẽ bị phân giải bởi nhiều phương thức: bằng các enzyme phân giải tự do trong tế bào chất hoặc dịch nhân, phân giải trong các proteasome là tổ chức hình ống trong chứa các protease. Ubikinin là loại protein đặc thù thường gắn vào protein bị phân giải rồi chuyển đến proteasome để phân giải tại đó.

2.3.2. Đặc tính của protein

- Điểm đẳng điện (Isoelectric point - pI): Là pH tại đó tổng điện tích của phân tử protein bằng không. Mỗi protein tuỳ theo gốc R có chứa nhóm –NH2 hay –COO- mà tại pI đó có pH kiềm hay acid, để duy trì nguyên pH vốn có của protein người ta thường dùng chất ampholyte.

- Ampholyte: Là chất có hoạt tính trong cả môi trường acid và bazơ, ampholyte mất proton (điện tử) ở phía kiềm của điểm đẳng điện và thu nhận proton ở đầu acid của điểm đẳng điện. Cho nên khi ampholyte tương tác với protein sẽ giữ nguyên pH vốn có của protein trong trường điện di. Chất này có thể duy trì được một phạm vi pH nhất định tuỳ theo sản phẩm của nhà sản xuất. Thí dụ ampholyte 7 - 14 sẽ giữ nguyên được pH của những protein nào có pH từ 7 – 14.

- Enzyme: Là một dạng protein có khả năng xúc tác cho những phản ứng hoá sinh học, nó khác so với những chất vô cơ khác bởi tính đặc thù cao của mình, có nghĩa là chúng chỉ xúc tác cho những phản ứng có liên quan đến một hoặc một vài chất tương đồng nhau, và chúng có khả năng phân biệt được giữa những chất đồng phân lập thể (stereoisomer).

- Các enzyme khi đu​ợc tách chiết ra khỏi cơ thể sống chúng vẫn có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng cùng loại ở bên ngoài tế bào.

- Hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3, 4 và trạng thái tự nhiên của phân tử protein enzyme đó.

- Một số enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác không cần sự có mặt của các yếu tố khác ngoài phân tử protein enzyme. Số khác thì yêu cầu ngoài phân tử protein enzyme ra khi muốn có hoạt tính xúc tác thì cần sự phối hợp tác động với một số ion kim loại khác như​: Fe+ 2, Mg+2, Mn+2 hoặc Zn+2, các nguyên tố kim loại này như​ là các nhóm thêm - prosthetic.

- Một vài enzyme khác thì lại cần sự có mặt và phối hợp hoạt động với các phức hữu cơ hoặc phức hữu cơ với kim loại để tạo thành phức hợp đồng enzyme (coenzyme), làm thay đổi đặc tính, định hướng di chuyển mới có thể thực hiện được hoạt tính xúc tác của mình. Người ta gọi phần protein của enzyme là apoenzyme, còn các đồng yếu tố gọi là coenzyme. Phức hợp chứa cả 2 phần là protein và coenzyme của enzyme thì được gọi là enzyme hoàn chỉnh (holoenzyme).

- Phần phân tử protein enzyme chứa các nhóm chức, trực tiếp kết hợp với cơ chất để hình thành phức hợp enzyme – cơ chất, xúc tác phản ứng cơ chất tạo thành sản phẩm của phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme.

- Phần lớn các enzyme có tác dụng xúc tác cho các phản ứng như​: oxy hoá khử, vận chuyển, thuỷ phân, thêm một nhóm hoá học vào liên kết kép (lyases), xúc tác cho việc chuyển nhóm hoá học nội vi phân tử hình thành lên các đồng phân (isomerases) hoặc xúc tác cho việc hình thành các liên kết giữa C - C, C - S, C - O hoặc C – N (ligases).

- Hầu hết tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởi enzyme ở độ pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường, trong khi đó đa số các chất xúc tác vô cơ lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao. Sở dĩ enzyme có khả năng xúc tác tuyệt vời như​ vậy vì nó tạo được môi trư​ờng đặc hiệu có lợi nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng. Môi trư​ờng đặc hiệu trên được tạo bởi trung tâm hoạt động liên kết với cơ chất mà nó xúc tác, phức hợp enzyme - cơ chất (E-S) có năng l​ượng hoạt hoá thấp đã cho phép phản ứng xẩy ra ở nhiệt độ cơ thể sinh vật.

- Hiện nay nguời ta đã tổng hợp nhân tạo được một số enzyme có hoạt tính phân giải ester giống như chymotrypsin từ các nguyên liệu ban đầu có cấu trúc phân tử thấp như cyclodextrin (có 6 – 10 gốc D-glucose, đầu nối đuôi tạo thành vòng) sau đó gắn thêm các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme. Hoặc người ta tổng hợp nhiều peptide riêng rồi nối chúng lại tạo thành E hoặc ghép một enzyme vào một khung cấu trúc khác để tạo ra enzyme mới. Những enzyme này gọi là synzyme.

- Người ta đã phát hiện ra một số kháng thể cũng có chức năng enzyme gọi là Abzyme và một số RNA cũng có hoạt tính xúc tác như enzyme gọi là ribozyme.

2.3.3. Cách gọi tên enzyme

Phần lớn các enzyme thường đư​ợc gọi tên theo quy tắc lấy tên của cơ chất mà nó chịu trách nhiệm xúc tác cộng với đuôi ase. Năm 1961 Uỷ ban về enzyme của Hội hóa sinh và sinh học phân tử quốc tế (IUBMB) đ​ưa ra bảng phân loại enzyme chi tiết và có hệ thống. Toàn bộ enzyme tồn tại trong tự nhiên đ​ược chia làm 6 lớp, mỗi lớp có những lớp phụ được phân biệt với nhau theo kiểu phản ứng mà chúng xúc tác. Mỗi enzyme đều có một mã số EC nhất định, quy định này đ​ược áp dụng trên phạm vi toàn cầu. Thí dụ enzyme esterase là một nhóm enzyme không cùng nguồn, ít biểu hiện khả năng chuyên hóa cơ chất, chúng có chung một đặc tính là phá huỷ liên kết este của acid cacbonic trong tất cả các chất có nguồn gốc từ naphthol, indoxil và methylumbelliphrin. Theo cách phân loại quốc tế này thì enzyme esterase được xếp vào lớp thứ 3, lớp hydrolase, lớp phụ thứ nhất chỉ tác động lên este và tiểu phân lớp 1 tác động lên liên kết este của cacbocylic acid. Kí hiệu là: EC.3.1.1 (EC: enzyme commission). Enzyme này lại được chia ra thành 4 nhóm tuỳ theo cơ chất là:

Cacboxyl esterase EC.3.1.1.1

Aryl esterase EC.3.1.1.2

Acetylcholin esterase EC.3.1.1.7

Cholin esterase EC.3.1.1.8

Ghi chú: chữ số cuối cùng chỉ số thứ tự của enzyme. Đây là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu biến dị di truyền của quần thể động, thực vật vì tính biến dị của nó ở trong loài là khá lớn.

2.3.4. Khái niệm về isozyme

a. Khái niệm

- Isozyme là những trạng thái khác nhau của một enzyme, các isozyme của một enzyme đều xúc tác cho cùng một phản ứng, chỉ khác nhau ở một số tính chất như​ ở pH hoặc nồng độ cơ chất tại đó chúng xúc tác tốt nhất.

- Isozyme là những protein phức được tạo thành từ những tiểu phần polypeptide. Thí dụ enzyme dehydrogenase khử hydro của lactic acid, là enzyme có 4 cấu tử được tạo thành từ 2 tiểu phần polypeptide là a và b. Do vậy sẽ có 5 isozyme tồn tại là: aaaa, aaab, aabb, abbb, bbbb.

- Isozyme thường có điểm đẳng điện khác nhau bởi vậy chúng dễ dàng tách nhau ra được bằng phương pháp điện di.

- Đứng về mặt di truyền thì các tiểu cấu tử polypeptide này có thể do các locus gen khác nhau tạo ra, hoặc cũng có thể do các trạng thái alen khác nhau của một locus gen tạo ra, trong trường hợp này gọi là allozyme.

b. Nguyên nhân gây hiện t​ượng đa hình của enzyme

- Tru​ờng hợp đa hình enzyme tạo nên isozyme do nhiều locus gen khác nhau quy định. Theo Watts (1968) giải thích là do hiện tư​ợng lặp đoạn locus gen ban đầu quy định tạo ra enzyme đó, và sau đó là sự phân hóa theo nhiều hướng trong quá trình tiến hoá của sinh vật. Như​ vậy, trong tr​ường hợp này tính đa hình của enzyme phụ thuộc cả vào số lượng locus và số lượng alen của từng locus.

- Trư​ờng hợp đa hình enzyme do kết quả của các đột biến gen tạo nên các alen khác nhau làm thay đổi cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptide gọi là allozyme.

- Ngoài ra tính đa hình của enzyme còn do cơ chế biến đổi sau giải mã, tức biến đổi sau khi chuỗi polypeptide được tổng hợp, có thể các chuỗi polypeptide của một phân tử enzyme được tổ hợp lại với nhau tạo thành cấu tử đa phân. Trong các cấu tử đa phân nếu các thành phần đều giống nhau thì chúng tập hợp thành cấu tử đồng polyme, nếu các thành phần tạo nên cấu tử đa phân khác nhau tức do các alen khác nhau của một locus hoặc cũng có thể do các alen khác nhau của các locus tạo thành thì sản phẩm sẽ tạo thành cấu tử dị polyme.

- Thuyết một gen một enzyme là thuyết cho rằng phần lớn các gen tồn tại, mỗi gen kiểm tra việc tổng hợp hoặc hoạt động của một enzyme (Beadle & Tatum 1941 và Mitchell &Lein 1948).

- Thuyết một gen một polypeptide là giả thuyết cho rằng phần lớn các gen tồn tại, mỗi gen kiểm tra việc tổng hợp một polypeptide. Polypeptide có thể hoạt động độc lập hoặc là một tiểu cấu tử của một protein phức. Thuyết này thay thế giả thuyết một gen một enzyme, từ khi phát hiện ra enzyme đa nguyên (heteropolymeric enzyme), thí dụ enzyme hexosaminidase được mã hóa bởi 2 gen được gọi là hai gen – một chuỗi polypeptide (two genes - one polypeptide chain).

- Tập hợp tất cả các protein có trong một cơ thể sinh vật được gọi là hệ protein (proteome). Như vậy mỗi một tế bào, mô và cơ quan có một proteome tương ứng. Proteomics là khoa học nghiên cứu hệ protein sinh vật. Người ta đã xác định được ở Eukaryote có khoảng 4000 đến 10.000 họ protein, trong đó có 3000 họ chủ yếu và có khoảng 1000 họ tương đồng với prokaryote. Ở cơ thể người ước tính có khoảng 80.000 đến 100.000 loại protein khác nhau được mã hoá bởi khoảng 32.000 gen.

Trên cơ sở hiểu biết về cấu trúc bậc một, cấu hình không gian và chức năng của protein, các nhà công nghệ sinh học có thể dựa vào các phần mềm tin sinh học thiết kế nhân tạo được môt số protein theo ý muốn để sử dụng trong các ngành công nghiệp như: dược phẩm, công nghệ tẩy giặt và chế biến thực phẩm.

2.3.5. Một số chức năng quan trọng của protein

- Là enzyme xúc tác cho các phản ứng hóa học với đặc tính là có khả năng xúc tác lớn và tính đặc hiệu cao. Tên gọi một enzyme bao gồm tên cơ chất mà enzyme tiến hành phản ứng phân giải cộng với đuôi ase. Khi phân giải, cơ chất tương tác với enzyme theo 2 cơ chế:

+ Phù hợp về điện tích hay hình dạng để tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất.

+ Khi cơ chất gắn vào enzyme sẽ làm thay đổi cấu hình enzyme và hoạt hoá nó.

- Khi các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ tương tác hóa học yếu giữa các nhóm amino acid, tạo cho chúng có cấu trúc không gian 3 chiều quyết định chức năng của protein.

- Nhiều protein hình thành lên dạng chão dài, một số khác tạo lên cấu hình có các hốc gắn cơ chất. Các hốc được bao quanh bởi những nhóm amino acid lân cận thích hợp để tiếp xúc dễ dàng với cơ chất và xẩy ra phản ứng. Ví dụ hoạt tính xúc tác của Trypsine và Chymotrypsine.

- Protein là hormon, chất điều tiết sinh trưởng gồm những chất hoá học do tế bào hoặc cơ quan tiết ra vào dịch cơ thể động thực vật có tác dụng điều hoà hoạt động của tế bào hoặc mô đích. Hiện nay người ta đã biết trong cơ thể người có khoảng 50 hormon. Có 2 loại hormon là steroid và hormon thuộc amino acid. Nhóm hormon steroid là các hormon sinh dục (estrogen, testosteron...) có xuất xứ từ cholesterol. Nhóm amino acid thường có nguồn gốc từ các amino acid, peptide, oligopeptide, từ protein hoặc oligoprotein.

+ Pheromon là tín hiệu hoá học có chức năng giống hormon chỉ khác là tín hiệu thông tin tín hiệu giữa các cá thể cùng loài trong quần thể theo chức năng như quyến rũ, chất đánh dấu hoặc báo động, chúng có khả năng bay hơi và tác động chỉ cần một lượng ít.

+ Chất trung gian thần kinh (neurotransmitter) có bản chất là dẫn xuất của amino acid là amino acid hoặc oligopeptide.

+ Các chất kích thích sinh trưởng thường có bản chất peptide hoặc protein làm nhiệm vụ điều hoà sinh trưởng của tế bào và phát triển của mô (EGF – epidermal growth factor) có tác dụng kích thích sự phân bào và phát triển biểu bì. Nhân tố sinh trưởng thấn kinh (NGF - nerve growth factor) có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào thần kinh, bạch cầu, tế bào sợi...

+ Prostaglandin là acid béo đã bị biến đổi do nhiều loại dịch tiết vào mô và có tác dụng điều hoà hoạt động của tế bào bên cạnh bằng nhiều cách như: Prostaglandin do nhau thai tiết ra có tác dụng kích thích cơ dạ con giúp cho sự đẻ con dễ dàng, nhiều prostaglandin kích thích hiện tượng viêm và sốt cũng như là gây đau để báo động cơ thể chống lại nguy hiểm (chất aspirin làm giảm đau, giảm sốt là do chúng ức chế prostaglandin.

- Protein có khả năng nhận biết các loại phân tử khác nhau, thí dụ như kháng thể chẳng hạn. Bất kỳ một tác nhân miễn dịch nào tiêm vào cơ thể động vật có xương sống cũng kích thích sinh ra kháng thể. Tiêm insuline bò cho người thì người sẽ tạo ra kháng thể chống lại kháng nguyên bò, mặc dù insuline của người và bò chỉ khác nhau có 3 amino acid.

- Protein có chức năng vận động, điển hình là myosine.

- Protein làm nhiệm vụ bảo vệ khi đó nó là độc tố, tiêu diệt hoặc kìm hãm kẻ xâm nhiễm.

- Protein dự trữ, hay cấu trúc như protein dự trữ trong hạt đậu tương, cây ngũ cốc.

- Protein kích động làm nhiệm vụ hoạt hóa gen, là chất truyền tín hiệu điều khiển quá trình hoạt hoá gen.

2.4. LIPID

2.4.1. Cấu tạo

Bao gồm các chất hóa sinh có khả năng hòa tan khác nhau trong các dung môi hữu cơ như alcohol, ít hòa tan trong nước như chất béo, dầu, sáp, phospholipid, sterol, carotenoid.

Đơn vị cấu tạo lên lipid là các acid béo, được cấu tạo từ một mạch hydrocarbon liên kết C và H (CH). Có 2 loại acid béo là: acid béo no (bão hòa) và acid béo không no (không bão hòa). Các acid béo khác nhau bởi số lượng các nhóm CH và số liên kết đôi, đơn khác nhau trong phân tử.

Bảng 2 - 1. Cấu trúc một số acid béo tiêu biểu trong hệ thống sống

Công thức hóa học

Tên thông thường

Acid béo no

CH3(CH2)10COOH

CH3(CH2)12COOH

Acid béo không no

CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH

CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH

Lauric

Palmitic

Palmitoleic

Oleic

2.4.2. Tính chất

Lipid đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành và duy trì tính phân cực của tế bào. Người ta phát hiện trong tế bào của một thể đột biến mất khả năng phân cực thấy chúng mất khả năng tổng hợp sterol, các protein có gắn glycosylphosphatidylinositol và tín hiệu phospholipid, đây là các chất giúp tế bào có khả năng phân cực.

Lipid là nhân tố chính hình thành nên cấu trúc màng sinh học của tế bào. Có đặc tính không ưa nước do tương tác giữa phospho và lipid tạo thành. Cấu tạo màng nguyên sinh chất gồm: đầu phân cực quay ra phía ngoài dung dịch, ngược lại đầu kỵ nước lại quay vào phía trong. Protein (P) xen kẽ vào giữa lớp cấu trúc này, thỉnh thoảng protein tiếp xúc với bề mặt bên ngoài và trong, lúc khác có thể lại xuyên qua cả 2 phía. Khi protein lộ ra bề mặt bên ngoài màng tế bào thì thường có vai trò như là chất nhận và truyền tín hiệu, phân biệt kháng nguyên hay truyền hormon vào trong tế bào. Protein màng đóng vai trò như là nhân tố liên lạc, truyền thông tin và năng lượng, vận chuyển những phân tử đặc hiệu qua màng tế bào. Lipid dự trữ để cung cấp năng lượng. Các nguồn lipid khác nhau sẽ có cấu trúc và tính chất thủy phân khác nhau.

Lipid chứa acid béo không no dễ bị oxy hóa dẫn đến bị aldehyt hay ôxi hóa.

Acid béo no: CH3(CH2)10COOH: lauric acid, CH3(CH2)12COOH: palmitic acid

Acid béo không no: CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH: palmitoleic acid CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH: oleic acid.

2.5. POLYSACCHARIDE

2.5.1. Cấu tạo

- Tham gia vào cấu tạo tế bào và là nguồn cung cấp năng lượng.

- Được cấu tạo từ các monomer là đường đơn (monosaccharide). Các monosaccharide thường là glucose, nối với nhau bằng liên kết glycosidic.

- Polysaccharide gồm có: Cellulose, chitin, glycogen, carbohydrate và tinh bột.

- Cellulose là một polysaccharide cấu tạo từ β – D – glucose, có ở thành tế bào thực vật giúp tế bào chống đỡ định hình được, cho phép nước và gần một nửa chất hữu cơ đi qua lại qua thành tế bào.

- Chitin có cấu tạo tương tự như cellulose, cũng không phân nhánh, nhưng khác là nhóm OH được thay bằng -NH-CO-CH3. Chitin được tìm thấy nhiều ở vở tôm, cua, lớp vỏ cutin của các loài côn trùng chân đốt, thành tế bào một số loài nấm và tảo lam.

- Glycogen: là một dạng polysaccharide phân nhánh tìm thấy trong tế bào động vật và tảo lam. Ở người và một số động vật có xương sống chúng được dự trữ trong gan chiếm 10%. Khi đói glycogen phân giải tạo thành đường glucose, khi không đói chúng lại được tích lũy lại ngay.

- Tinh bột: Là polysaccharide được dự trữ trong tế bào của hầu hết các loài thực vật và một số vi khuẩn. Tinh bột có hai dạng là amylose và amylopectin cấu tạo từ (-D-glucose và là phân tử dự trữ năng lượng của tế bào, thường tồn tại dưới dạng các hạt tinh bột.

2.5.2. Vai trò

- Là nguồn dự trữ năng lượng trong tế bào do chúng có cấu tạo phân tử lớn, không hòa tan trong nước nên không tạo lên áp suất thẩm thấu hoặc tính chất hóa học của tế bào. Chúng có thể cuộn lại thành một hình thể vững chắc, sẵn sàng chuyển thành đường khi cần thiết. Ở động vật nguồn dự trữ năng lượng chính là glycogen. Glycogen là một polysaccharide hòa tan, được tạo thành từ một số lớn các phân tử đường glucose, chúng được dự trữ ở gan và cơ. Nếu tích lũy quá nhiều glycogen cũng gây ra bệnh.

- Glycolipid là hợp chất giữa lipid và carbohydrate, tìm thấy trong màng nguyên sinh chất của tế bào.

- Ở thực vật dự trữ tinh bột (amylose, amylopectin).

- Đường đơn, đường kép, các loại đường khác nhau có độ ngọt và cấu trúc khác nhau.

- Glycoprotein: là protein chứa lượng nhỏ carbohydrate (thường < 4%).

2.6. GIỚI THIỆU MỘT SỐ HOẠT CHẤT THỨ CẤP SINH HỌC

- Actinomycin D: là một chất kháng sinh, được sinh ra từ nấm Streptomyces chrysomallus, có tác dụng ngăn cản quá trình phiên mã tạo mRNA của sinh vật.

- Allatum hormon được tổng hợp từ loài côn trùng Corpus allatum, ảnh hưởng đến đặc tính số lượng của mỗi con ngài của loài côn trùng biến thái hoàn toàn. Ở nồng độ cao kích thích phát triển thành ấu trùng còn nồng độ thấp kích thích tạo thành nhộng, nếu không có hormon này thì chúng phân hóa thành con trưởng thành. Vì thế người ta gọi hormon này là hormon non, con cái trưởng thành cần hormon này.

- Abscisic acid, ABA, là một hormone thực vật, được hình thành do quá trình phân giải carotenoid, kiêm tra tính rụng hoa quả của cây nhưng không làm lá rụng. Có tác dụng làm đóng khí khổng, tính ngủ của chồi, hạt và muốn nẩy mầm thì cần được sử lý các vật liệu này trong điều kiện nhiệt độ thấp.

- Actinomycin D là chất kháng sinh được chiết xuất từ nhiều loài vi khuẩn Streptomyces, nông độ thấp ức chế quá trình phiên mã nhưng không ức chế tái bản DNA.

- Aflatoxin gồm nhiều loại hợp chất gây độc như B1, B2, G1 và G2 do nấm Aspergillus flavus và một số nấm khác cùng chi sinh ra. Có tác dụng bọc lấy các purine làm quá trình ghép cặp không tiến hành được vì thế chúng ức chế quá trình tái bản DNA và RNA. Là một chất có độ độc tính cao và có thể gây ưng thư, thường có trong hạt cây có dầu bảo quản trong điều kiện ẩm thấp.

- Amatoxin là một chất độc do Amanita phalloides sinh ra, tác dụng ức chế quá trình phiên mã tế bào nhân thật nhờ tương tác với RNA polymerase II nhưng không ảnh hưởng đến enzyme RNA polymerase của ty thể và lạp thể. Chất alpha amanitin thường được sử dụng trong các thí nghiệm gây ức chế quá trình phiên mã gen.

- Caffeine có nhiều trong chè và cà phê và các đồ uống chế biến từ chúng, là một chất nhận adenosine (A1 và A2), kích trhisch hệ thống trung ương thần kinh.

- Calcimycin là chất kháng sinh yếu, chiết tách tù nấm Streptomycine chartreusensis, là chất cấu trúc phức acid lypophilic 523 Da monocarboxylic.

- Cocain là một chất alkaloid chiết xuất từ lá khô cây của một loài cây bụi ở Nam Mỹ, Erythroxylon coca hoặc có thể tổng hợp được, có tác dụng kích thích thần kinh và gây mê.

- Myricetin là một chất thơm, có nhiều trong nhiều loài thực vật, tác dụng ức chế nhiều enzyme như : alpha- glucosidase, xanthine oxidase và glyoxalase.

- Morphine là loại thuốc phiện nhóm alkaloid quan trọng, khi bị diacetate ester sẽ thành heroin.

- Muscarine là một alkaloid độc tố, có ở giống ruồi đỏ agaric Amanita muscaria và một số loài nấm mũ.

- Saponin có nhiều dạng tồn tại trong thực vật, chúng cấu tạo gồm một aglycon, steroid kết hợp với một phân tử đường có thể là glucose, galactose, pentose hay methylpentose. Tất cả các saponin đều tạo bọt mạnh với nước khi bị lắc mạnh. Là chất có hoạt tính trên bề mặt màng, nồng độ thấp làm tăng tính thấm tế bào, khi tiêm sẽ gây độc nhưng ăn vào thì không độc vì không hấp thụ qua ruột.

- Stevioside là một chất glycoside được chiết tách từ lá cây Stevia rebaudiana, dùng làm chất tăng độ ngọt lên 300 lần so với đường sucrose.

- Reserpine là một alkaloid chiết tách từ rễ cây Rauwolfia dùng để chống lại bệnh cao huyết áp.

- Tannin là nhóm các sản phẩm các chất polyphenol thực vật, dùng trong công nghệ thuộc da động vật

- Và rất nhiều chất thứ cấp sinh học khác được trình bày trong từ điển : Oxford Dictionary oF Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition và trong từ điển A Dictionary of Genetics, Fourth Edition, tác giả : Robert C. King và William D. Stansfield.

2.7. KẾT LUẬN

Mỗi đại phân tử có cấu tạo đặc trưng riêng, nhưng hoạt động của chúng lại phối hợp mật thiết với nhau. Thí dụ: nucleic acid kết hợp với protein tạo thành nucleoprotein, loại protein có khối lượng phân tử nhỏ là protamine, loại phân tử lớn là histone. Những amino acid kiềm của protein loại này có tác dụng làm trung hòa những acid phosphoric của DNA, đặc biệt là ở sinh vật nhân thật.

Trong khi cấu trúc và tính chất của nucleic acid, lipid và polysaccharide của các loài sinh vật tương đối đồng nhất thì protein lại không như vậy, ví dụ protein có cấu tạo bao gồm vùng ưa nước, kị nước, vùng gắn thêm đường, vùng có hoạt tính xúc tác, vùng liên kết với nucleic acid hay một protein khác. Tất cả các hoạt động hóa sinh lý của tế bào đều cần có sự tham gia của protein như quá trình hình thành vật chất thông tin di truyền, truyền đạt thông tin di truyền, chuyển hóa năng lượng, cử động tế bào, sự liên lạc giữa các tế bào. Tuy giữa chúng tồn tại sự đa dạng vô cùng to lớn, nhưng về cơ bản chúng đều là những protein.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Đặc điểm các đại phân tử sinh học và tiểu phân tử. Nêu thí nghiệm chứng minh DNA là vật chất mang thông tin di truyền.

2. Cấu tạo DNA theo Watson và Crick, quy tắc Chargaff. Đặc tính và ứng dụng.

3. Nêu và mô tả cấu trúc RNA, đặc điểm giống và khác nhau so với DNA.

4. Cấu tạo và vai trò của mRNA, tRNA, rRNA. Sự giống và khác nhau giữa mRNA và DNA của sinh vật eukaryote và prokaryote.

5. Thành phần và cấu trúc protein. Tính chất của protein phụ thuộc vào yếu tố gì, tại sao

6. Phân biệt sự giống và khác nhau giữa peptide, polypeptide, protein và enzyme.

7. Nêu đặc tính và chức năng của enzyme và ứng dụng trong phân tích và trong sản xuất.

8. Isozyme, nguyên nhân gây hiện tượng đa hình isozyme, hệ protein. Quần thể tự phối và giao phối thì quần thể nào có đa hình isozyme cao hơn, tại sao.

9. Nêu chức năng của protein. Tại sao nói hoạt động sống là thể hiện hoạt động chức năng của hệ protein trong cơ thể.

10. Nêu tóm tắt cấu tạo và chức năng của lipid, polysaccharide. Khi kết hợp với protein tính chất của protein có thay đổi không, tại sao.

11. Nêu đặc tính cấu tạo, nguồn gốc và chức năng của 5 hoạt chất sinh học thứ cấp.

Chương 3

LIÊN KẾT HÓA HỌC YẾU TRONG HỆ THỐNG SỐNG

Các phân tử sinh học tồn tại trong cơ thể sinh vật được tạo thành và tương tác kết hợp với nhau theo một thể thống nhất, hỗ trợ, bổ sung nhau, tạo ra một chất mới với đặc tính mới. Trong chương này chúng ta sẽ đề cập đến các liên kết cơ bản tạo nên một chất hóa sinh và tương tác giữa các phân tử tạo nên một phức chất sinh học.

3.1. ĐỊNH NGHĨA VÀ ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC LIÊN KẾT HÓA HỌC

3.1.1. Định nghĩa

Liên kết hoá học là lực hút giữa 2 (hoặc nhiều) nguyên tử với nhau. Tổ hợp giữa các nguyên tử, có một kích thước xác định sẽ hình thành lên một phân tử. Các nguyên tử trong một phân tử liên lạc đ​ược với nhau là do lực liên kết cộng hoá trị quyết định. Lực liên kết là năng lượng cần thiết để phá vỡ nó. Có 2 liên kết là liên kết cộng hóa trị (có lực liên kết mạnh) và liên kết hóa học yếu (có lực liên kết yếu). Liên kết giữa các đơn vị thành phần của một phân tử chủ yếu là do liên kết cộng hóa trị, còn liên kết hóa học yếu lại đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên các cấu trúc với những phân tử khác, tạo thành một thể thống nhất hài hòa, có trật tự nhất định, để đảm nhận đ​ược các chức năng của một tế bào và cơ thể sống.

3.1.2. Xếp loại các liên kết hoá học

Dựa trên 3 đặc trưng chính sau đây:

Lực liên kết và năng lượng để phá vỡ nó

- Lực liên kết mạnh hay yếu, ví dụ nếu là liên kết cộng hóa trị thì có lực liên kết mạnh, bền vững và khó phá vỡ.

- Liên kết yếu, dễ bị phá vỡ, tồn tại thời gian ngắn. Chỉ khi kết thành khối nhóm mới có thể tồn tại được lâu dài.

- Năng lượng dùng để phá vỡ hoặc hình thành một liên kết cộng hoá trị cần phải lớn, ví dụ muốn phá vỡ liên kết C-C thường cần 58,6 Kcal/mol, trường hợp muốn phá vỡ liên kết C – C trong phân tử ethane thì phải cần tới 83 Kcal/mol. Trong khi đó phá vỡ liên kết yếu chỉ cần từ 1 – 5 Kcal/mol, ở nhiệt độ sinh lý 370C của ng​ười cũng có thể phá vỡ đ​ược nhiều liên kết hóa học yếu.

Số lượng liên kết

Trong liên kết cộng hóa trị, số lượng liên kết hóa học tối đa của một nguyên tử có thể tham gia được gọi là hóa trị, thí dụ oxy hóa trị 2, trong khi đó liên kết hóa học yếu có số liên kết ngoài tùy thuộc vào số lượng nguyên tử ra còn phụ thuộc vào mức độ tiếp xúc với nhau về không gian ví dụ như liên kết Van der Waals.

Góc liên kết

Góc liên kết cộng hóa trị thường có góc cố định, đối với liên kết yếu, thì góc liên kết thường hay thay đổi.

3.2. BỐN LOẠI LIÊN KẾT YẾU CƠ BẢN

3.2.1. Liên kết hydro

- Là tương tác giữa một nguyên tử mang điện tích âm (gọi là nguyên tử nhận A) với một nguyên tử hydro nằm trong một nối cộng hóa trị với nguyên tử khác (gọi là nguyên tử cho D). Thí dụ N trong liên kết N-H và O trong liên kết O-H là những nguyên tử cho chính:

D-H + A(( D-H…A

- Liên kết cộng hóa trị giữa D và H phải là liên kết phân cực và đám mây điện tử của A phải mang những điện tử không liên kết và có khả năng thu lực điện tích (+ của H.

- Năng lượng để phá vỡ liên kết này là khoảng 5Kcal/mol.

- Các nguyên tử H, nguyên tử cho D và nhận A đều xếp thành một đường thẳng.

- Trong hệ thống sống có 4 loại liên kết H là:

+ Giữa O với H của 2 nhóm peptide.

+ Giữa O với H của 2 nhóm hydroxyl.

+ Giữa O với H của gốc Carboxyl và OH của tyrosine.

+ Giữa O với H của nhóm Carboxyl mang điện tích với amin

Hình 3 - 1. Cấu trúc liên kết yếu mạng của phân tử n​ước

- Nhờ liên kết hydro mà các phân tử mang chúng dễ hoà tan được ở trong nước do liên kết hydro giữa chúng với phân tử nước.

- Phân tử nước chiếm chủ yếu của vật chất sống luôn hình thành một mạng lướí tứ diện đều đặn dù ở trạng thái rắn hay lỏng (hình 3-1).

3.2.2. Liên kết ion

- Là tương tác tĩnh điện giữa 2 nhóm nguyên tử có điện tích ngược dấu. Trong nhiều hợp chất vô cơ, điện tử liên kết th​ường bị hút về nguyên tử tích điện âm, gây ra sự phân ly thành các cation và anion. Thí dụ NaCl phân ly thành Na+ và Cl-, là hợp chất phân cực do điện tử liên kết luôn bị hút về phía nguyên tử tích điện âm (Cl-) cho nên đã tạo ra phân li này.

- Vì điện tử liên kết không phân đều cho 2 nguyên tử nên không xếp vào loại liên kết cộng hóa trị.

- Liên kết ion không có định hướng trong không gian như liên kết cộng hóa trị và liên kết hyđro vì điện trường phân bố đồng đều quanh ion.

- Trong môi trường nước, các cation và anion luôn được vây bọc bởi các phân tử nước tạo thành lớp vỏ ngoài, nên không thể liên kết với các anion và cation khác được.

Do vậy, nó không đóng vai trò quan trọng quyết định cấu hình không gian của đại phân tử hữu cơ.

3.2.3. Liên kết Van der Waals

- Là tương tác không đặc thù, xuất hiện giữa 2 nguyên tử khi chúng tiến đến gần nhau. Tương tác này không do phân phối lệch của các điện tử giữa 2 phân tử mà do biến động thoáng qua của các đám mây điện tử gây ra sự phân cực nhất thời trên phân tử.

- Liên kết Van der Waals không phụ thuộc vào tính phân cực của phân tử mà phụ thuộc vào khoảng cách giữa chúng.

- Lực liên kết được tạo thành là nhờ kết quả của các lực hút và đẩy giữa các phân tử, nó cân bằng ở khoảng cách nhất định tùy loại nguyên tử, khoảng cách này gọi là bán kính Van der Waals.

- Đây là lực liên kết yếu nhất, với giá trị chỉ bằng khoảng 1 Kcal/mol (hình 3 - 2).

Hình 3 - 2. Liên kết Van der waals hình thành phụ thuộc vào khoảng cách

- Liên kết này muốn có ý nghĩa thì cần phải tồn tại với số lượng lớn để tạo được diện tích bề mặt tiếp xúc giữa 2 phân tử phải lớn cực đại.

- Thí dụ điển hình là liên kết giữa kháng nguyên chứa một hốc có hình dạng phù hợp với chỗ lồi trên phân tử kháng thể (hình 3 - 3). Hoặc tư​ơng tự như thí dụ về liên kết giữa enzyme và cơ chất.

Hình 3 - 3. Mô hình tư​ơng tác liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể

3.2.4. Liên kết kị nước

- Là liên kết do các nguyên tử của phân tử không phân cực (không chứa nhóm ion) nên không có liên kết phân cực, tạo cho chúng không hòa tan được trong nước hay còn gọi là liên kết kị nước.

- Lực thúc đẩy liên kết giữa các phân tử hay giữa các vùng không phân cực của một phân tử thay vì với các phân tử n​ước được gọi là liên kết kị nước.

- Đây là một lực nhằm loại trừ các phân tử hoặc các nhóm phân tử không phân cực ra khỏi mạng nước.

- Lực liên kết thực sự có được của các phân tử không phân cực là lực liên kết

Van der Waals

- Liên kết kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc làm ổn định các protein và phức hợp của nó với các phân tử khác. Cũng như việc phân bố các protein trong các màng sinh học.

3.3. VAI TRÒ CỦA CÁC LIÊN KẾT HÓA HỌC YẾU

Liên kết hóa học yếu đóng vai trò rất quan trọng và thể hiện rất đa dạng trong cơ thể sống, đó là sự tư​ơng tác giữa enzyme với cơ chất, nhờ liên kết này đã hình thành lên cấu hình không gian của các đại phân tử có tác dụng điều hòa các hoạt động sống.

3.3.1. Trong tương tác enzyme - cơ chất

Khi xúc tác, các enzyme gắn một cách chọn lọc và tạo ái lực đặc biệt với cơ chất. Năng lượng liên kết của tương tác này thường từ 5 - 10Kcal/mol. Là liên kết hóa học yếu nên được hình thành và phá vỡ rất nhanh dưới tác động của nhiệt. Điều này giải thích tại sao enzyme có khả năng hoạt động với vận tốc đôi khi đạt đến 106 lần trong 1 giây. Nếu lực liên kết này lớn thì không thể có tốc độ cao đến như​ vậy, tuy nhiên tốc độ này còn phụ thuộc vào từng loại enzyme và cơ chất.

3.3.2. Trong cấu hình không gian của các phân tử

- Cấu hình của các đại phân tử được hình thành đều do hệ quả của liên kết hóa học yếu chứ không phải do liên kết cộng hóa trị.

- Liên kết kị nước làm ổn định phân tử protein nhưng quyết định tạo ra cấu hình đặc trưng lại là do các liên kết hydro. Vì liên kết hydro đòi hỏi một khoảng cách xác định và sự sắp xếp có định hướng các nguyên tử cho và nhận trong không gian. Khi các nguyên tử này nằm trên khung mạch thẳng polypeptide đã tạo lên cấu trúc bậc 2 đều đặn, chuỗi xoắn ( hay dạng nếp gấp (. Các cấu trúc đối xứng đều đặn như vậy có tính ổn định rất cao.

- Phân tử protein thường gồm cả 2 loại cấu trúc trên, bên cạnh đó còn có những vùng chứa cấu trúc không đều cần cho sự cuộn gấp của chuỗi polypeptide.

* Phân tử DNA thường có dạng xoắn kép do

- Hai mạch đơn bắt cặp với nhau nhờ liên kết bổ sung một purine (A&G) có cùng kích thước và bên kia C và T cũng có cùng kích thước. Điều này đảm bảo được khoảng cách đều đặn giữa 2 mạch đơn tạo thành tổng kích thước một purine = một pyrimidine.

- Chuỗi xoắn kép cho phép các bazơ purine và pyrimidine có cấu trúc phẳng, xếp chồng khít lên nhau ở bên trong phân tử DNA đã hạn chế sự tiếp xúc của chúng với nước.

- Các nguyên tử đường và các gốc phosphate xoay ra ngoài, liên kết với nước đảm bảo tính ổn định cho phân tử.

* Chuỗi xoắn kép DNA là một cấu trúc ổn định do:

- Nếu hai mạch đơn DNA tách nhau, các bazơ nitơ kị nước phải tiếp xúc với nước sẽ bất lợi và không ổn định.

- Mỗi phân tử DNA có một số lượng lớn nhất định các liên kết hydro cho nên dù bị chuyển động nhiệt làm phá vỡ những liên kết hydro ở 2 đầu phân tử, nhưng ở giữa phân tử nếu vẫn còn liên kết hydro thì sẽ gắn 2 sợi đơn lại chỉ khi bị nhiệt độ quá cao gần điểm sôi mới tách chúng ra được.

- Tuy nhiên cũng có một số tr​ường hợp bất bình thư​ờng như ở hình 3 - 4.

Hình 3 - 4. Các dạng xoắn không bình thường (phải) và bình th​ường (trái) của phân tử DNA

3.3.3. Các liên kết yếu đảm bảo mối liên lạc giữa Protein và DNA

Các protein histone đóng vai trò tạo ra cấu trúc nén chặt DNA trong nhân nhờ các liên kết ion. Liên kết ion này được hình thành giữa các nhánh bên mang điện tích dương của histone với các nhóm phosphate mang điện tích âm của DNA. DNA được quấn quanh lõi những protein histone. Các protein histone đóng vai trò tạo ra cấu trúc nén chặt DNA trong nhân nhờ các liên kết ion. Nhiễm sắc thể lớn nhất của người được phát hiện chứa một phân tử DNA khổng lồ dài tới 85.000(m hoặc 8,5.108A°. Vậy làm thế nào để sợi DNA của nó nằm gọn vào một nhiễm sắc thể ở trung kỳ chỉ có đường kính 0,5 (m và dài 10 (m. Muốn vậy sợi DNA phải co xoắn lại 104 lần. Như vậy phải có quá trình co xoắn xảy ra, vấn đề đặt ra là thành phần nào của nhiễm sắc thể có liên quan đến quá trình co xoắn này và liệu các phân tử DNA của từng nhiễm sắc thể khi co xoắn trong từng nhiễm sắc thể xảy ra có theo cách khác nhau hay theo chung một cách? Trong genome có nhiều mức độ co xoắn khác nhau hay không. Rõ ràng là ở cả phân bào nguyên nhiễm và giảm nhiễm thì nhiễm sắc thể đều co xoắn mạnh hơn ở gian kỳ (interphase).

Khi quan sát nhiễm sắc thể phân lập bằng kính hiển vi điện tử thấy nó bao gồm một chuỗi các hạt hình cầu, hình ellipse có đường kính 110A0 và cao 60A0 (hình 3 - 5 và hình 3 - 6).

Khi nghiên cứu dùng enzyme phân rã DNA trong nhiễm sắc thể thì thu được các đoạn DNA dài khoảng 146 cặp nucleotide luôn được bảo vệ.

Hình 3 - 5. Ảnh kính hiển vi điện tử nhiễm sắc thể co xoắn tạo cấu trúc nucleosome tế bào chuột

Trong một thí nghiệm khác khi dùng enzyme (nuclease) phân rã từng phần nhiễm sắc thể người ta đã thu được 1 bộ những đoạn DNA có kích thước tách biệt nhau (hình 3 - 6), điều này chứng tỏ nhiễm sắc thể có cấu trúc lặp lại, đồng thời cũng chứng tỏ các chuỗi hạt trên chính là một dạng tổ chức cho phép phân tử DNA cư trú để tránh bị phân giải. Các hạt (bead) này được gọi là các nucleosome. Nối giữa các hạt là một đoạn DNA, thường có chiều dài khoảng từ 8 - 114 cặp bazơ, tuỳ loài sinh vật và tuỳ loại tế bào được gọi là đoạn DNA linker.

* Mỗi hạt chứa 146 cặp nucleotide quay xung quanh 1+3/4 vòng của 8 histone (gồm 2 phân tử của 4 histone) mỗi thứ là H2a, H2b, H3 và H4.

- Một tiểu cấu tử nhiễm sắc thể hoàn chỉnh (complete chromatin subunit) gồm một hạt, 1 DNA linker và thường có thêm trung bình 1 phân tử protein H1), kết hợp với những protein nhiễm sắc thể không thuộc vào gia đình histone.

- Nucleosome còn chứa (phân tử H1) có vai trò cuộn xoắn hạt nucleosome để hình thành nên sợi Chromatin (kích thước 300A0. Điều này có thể có liên quan đến quá trình tạo cấu trúc cao hơn của nhiễm sắc thể.

Hình 3 - 6. Cấu trúc nucleosome của nhiễm sắc thể

- Vấn đề đặt ra là tất cả các nhiễm sắc thể đều có cấu trúc nucleosome giống nhau như trên không. Bằng cách nào chạc tái bản đi qua được nucleosome trong quá trình sao chép DNA. Nucleosome có vai trò gì trong quá trình điều hòa và biểu hiện của gen.

Hình 3 - 7. Cấu trúc chromatin của nhiễm sắc thể co xoắn

Hình 3 - 8. Sản phẩm điện di của nhiễm sắc thể sau khi cắt bởi enzyme nuclease

Hiện nay người ta đã phát hiện được cấu trúc nucleosome ở những vùng hoạt động của nhiễm sắc thể, nhìn chung khác so với những vùng không hoạt động. Nhưng chi tiết của mối quan hệ này cần phải được làm sáng tỏ. Dù quấn quanh lõi histone nhưng sợi DNA bên ngoài bề mặt vẫn tiếp xúc với protein khác, đó là các enzyme tham gia vào quá trình sao chép như DNA polymerase, quá trình phiên mã như RNA polymerase hay các protein điều hòa hoạt động các gen. Các protein này nhận biết một trình tự xác định trên sợi DNA rồi gắn vào đó ở vị trí có các nhóm bazơ đặc trưng nhờ liên kết ion. Cơ chế nhận biết này chủ yếu là do kết quả của sự bổ sung hình dạng giữa protein và DNA. Do năng lượng liên kết yếu giữa các đại phân tử không đủ lớn để tạo ra mạng lưới cứng nhắc bên trong tế bào nên tế bào sống thường không bao giờ đặc lại được. Cũng chính nhờ lực liên kết yếu đó nên hiện tượng khuếch tán trong tế bào thường tăng mạnh, tất nhiên còn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của tế bào. Nhờ khuếch tán mạnh mà các phân tử khác nhau có cơ hội tiếp xúc được với nhau tạo để thực hiện nhiều phản ứng sinh học thiết yếu cho sự sống.

Tóm lại nhờ có một số lớn các liên kết yếu đã giúp các phân tử trong tế bào vừa liên lạc được với nhau vừa có tính linh động, mềm dẻo đây là đặc trưng cơ bản của sự sống . Việc hình thành lên cấu trúc sinh học phụ thuộc không những vào bản thân phân tử mà còn phụ thuộc vào các phân tử khác trong môi trư​ờng xung quanh. Cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến chứa năng cũng khác nhau.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Liên kết hóa học là gì. Liên kết hóa học yếu có đặc điểm gì so với liên kết cộng hóa trị.

2. Có mấy loại liên kết hóa học yếu, có thể tác động làm thay đổi các liên kết này không.

3. Vai trò của liên kết hóa học yếu trong hệ thống sống là gì. Vai trò của nước trong việc tạo cấu trúc của các đại phân tử sinh học.

4. Nêu cấu trúc phân tử của nhiễm sắc thể, nucleosome, solenoid, vai trò của cấu trúc này.

Chương 4

GEN VÀ GENOME CỦA SINH VẬT

Mọi đặc tính của sinh vật đều do vật chất di truyền trong phân tử DNA quy định. Trong chương này chúng ta sẽ đề cập đến các khái niệm về gen, cấu trúc và thành phần của gen, sự giống và khác nhau giữa 2 sinh vật tiền nhân và nhân thật. Tập hợp các gen và tương tác giữa chúng tạo thành một hệ gen (genome).

4.1. ĐẶC ĐIỂM HAI HỆ THỐNG SINH VẬT

Giới sinh vật được chia ra làm hai nhóm sinh giới dựa trên cơ sở cấu trúc và thành phần tế bào là sinh vật tiền nhân (Prokaryote) đại diện là các vi khuẩn (Bacteria) và tảo lam (Cyanobacteria) và nhân chuẩn (Eukaryote) bao gồm thực vật, động vật và người.

Hình 4-1. Cấu trúc tế bào Prokaryote và Eukaryote

Tế bào Prokaryote chưa có nhân hoàn chỉnh nên gọi là sinh vật tiền nhân, chúng không có phần lớn các bào quan và màng nhân, có vùng tương tự nhân gọi là nucleoid, bên trong chứa bộ gen gồm DNA cấu trúc sơ khai không kèm và cuộn với protein histone gọi là nhiễm sắc thể sơ khai. Phân chia tế bào theo kiểu phân đôi, không có trung thể, không hình thành sợi tơ vô sắc và không có ty thể. Ngoài ra ở một số loài vi khuẩn có thể còn chứa thêm những dạng DNA vòng nhỏ gọi là plasmid hay các yêú tố di truyền ngoài nhiễm sắc khác. Tế bào của Eukaryote có đặc điểm nổi bật là có cấu trúc nhân hoàn chỉnh với màng nhân kép bao quanh, thỉnh thoảng bên trên có chứa các lỗ nhân. Trong tế bào có hệ thống màng phức tạp, chứa mạng lưới nội chất(nhẵn và hạt), bộ máy Golgi, lysosome, ty thể và lục lạp (ở sinh vật quang hợp). Nhiễm sắc thể của eukaryote thẳng, có cấu trúc phức tạp giữa DNA, RNA và các protein histone. Phát hiện sự giống và khác nhau giữa prokaryote và eukaryote là thành tựu to lớn của sinh học phân tử. Sự khác nhau này thể hiện rất rõ và xuyên suốt hàng loạt các đặc điểm từ cấu trúc gen, genome, DNA, mRNA, đến cơ chế điều hoà và biểu hiện của gen và genome.

4.2. GEN VÀ GENOME SINH VẬT NHÂN CHUẨN

4.2.1. Khái niệm và cấu trúc gen

a. Khái niệm

Gen là đơn vị di truyền, chiếm một vị trí nhất định (locus) trong genome hoặc trên nhiễm sắc thể, quyết định hoặc đóng góp vào việc hình một hoặc một số tính trạng của cơ thể sinh vật. Gen có thể đột biến thành nhiều dạng alen khác nhau. Gen có thể tái tổ hợp với những gen khác hình thành nên liên kết mới. Có 3 nhóm gen được phát hiện là: 1) gen cấu trúc phiên mã tạo ra các mRNA sau đó dịch mã thành chuỗi polypeptide, 2) gen cấu trúc phiên mã tạo thành phân tử rRNA hoặc tRNA được sử dụng trực tiếp và 3) gen điều hòa không phiên mã nhưng làm nhiệm vụ là nơi nhận biết cho enzyme hoặc protein liên quan đến tái bản và phiên mã DNA. Seymour Benzer đưa ra một số thuật ngữ: Gen là một cistron là lượng vật chất di truyền mã hóa cho một tRNA, rRNA hay một chuỗi polypeptide, nó bao gồm cả vùng phiên mã, trước và sau vùng phiên mã và cả các intron. Gen là một muton là đơn vị nhỏ nhất khi bị biến đổi, thay đổi mã di truyền tương ứng với một nucleotide. Gen là một recon là đơn vị nhỏ nhất có thể trải qua tái tổ hợp tương ứng với cặp nucleotide kề cạnh ở vị trí cis.

Thông tin di truyền của gen được mã hoá trong DNA dựa trên trình tự đặc hiệu của các nucleotide. Gen có chức năng sản xuất ra phân tử RNA hoặc một chuỗi polypeptide. Gen mã hoá tạo ra polypeptide thông qua hai quá trình:

Thứ nhất, gen cấu trúc hoạt động làm khuôn để sản sinh ra một phân tử mRNA (quá trình phiên mã).

Thứ hai, phân tử mRNA riêng biệt tương tác với các cấu tử khác như: ribosome, RNA vận chuyển mang amino acid (tRNA) và thông qua phản ứng của một số enzyme để sản sinh ra một phân tử protein (quá trình dịch mã).

Sơ đồ hoạt động của gen từ DNA đến protein như sau: DNA gen phiên mã tạo thành mRNA sau đó dịch mã tạo thành polypeptide, có thể phối hợp tạo thành protein hoạt động trong nội tại tế bào hoặc vận chuyển đi các tế bào và mô nơi khác.

b. Cấu trúc gen của sinh vật nhân chuẩn

Thành phần của gen: gen là một đơn vị di truyền trong sinh vật nhân chuẩn gồm:

- Các exon và intron của gen:

Exon là trình tự mang thông tin di truyền, nằm ở 3 vùng nhất định của gen, thường được mã hóa sang protein. Vùng một, không dịch mã thành protein, làm tín hiệu bắt đầu phiên mã tạo RNA và chứa trình tự định hướng mRNA vào ribosome để dịch mã tạo protein. Vùng hai gồm các exon chứa thông tin di truyền dịch mã thành trình tự amino acid của protein. Các exon vùng ba được phiên mã thành một phần của mRNA chứa tín hiệu để kết thúc dịch mã và cho phép gắn thêm đuôi poly A vào mRNA.

Intron hay trình tự ‘câm’’, nằm xen kẽ và không mang thông tin di truyền. Chúng được phiên mã đến tiền mRNA ở trong nhân, sau đó bị cắt bỏ trong quá trình biến đổi tiền mRNA thành mRNA chín và nhanh chóng bị phân rã và tất nhiên không được dịch mã thành protein. Số lượng các intron của gen biến động rất lớn từ có một intron ở gen tạo ra rRNA đến hơn 30 intron có ở gen tạo ra protein lòng đỏ trứng con Xenopus. Kích thước cũng rất biến động từ ngắn dưới 100 bp đến dài hơn 10.000 bp. Có rất ít trình tự tương đồng giữa các intron của một gen và của các gen khác nhau, nhưng chúng đều có một số nucleotide nằm ở 2 đầu các intron rất giống nhau, các nucleotide này tham gia vào quá trình cắt intron.

Hình 4 - 2. Sơ đồ cấu trúc gen ở sinh vật nhân thật

- Trình tự không dịch mã đầu 5’ UTR (untranslation region) được tính từ nucleotide phiên mã đầu tiên đến bộ 3 nucleotide khởi đầu dịch mã AUG hoặc GUG. Trình tự không dịch mã đầu 3’ UTR được tính từ một trong 3 codon dừng dịch mã đến hết trình tự kết thúc phiên mã.

- Trình tự kết thúc phiên mã của nhiều gen có trình tự như sau:

5’-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTT- 3’ trong đó chứa 2 đoạn dài 7 nucleotide (phần gạch chân) có trình tự bổ sung nhau, khi phiên mã sẽ tạo ra mRNA, ở đó hình thành nên cấu trúc kiểu kẹp tóc (hairpin) làm dừng quá trình phiên mã.

- Vùng khởi động (promoter) của nhiều gen sinh vật eukaryote đều có chung một số trình tự ở hộp CAAT (- 75) và TATA (-25).

Hình 4 - 3. Vùng khởi động phiên mã của gen ở eukaryote

- Mỗi gen có thể có một trình tự promoter nhất định, cũng có thể có nhiều gen có một trình tự promoter giống nhau. Hoạt động của promoter có thể đặc thù theo gen, theo sinh vật và thậm trí theo cả mô, cho nên khi thiết kế gen chuyển nạp thì cần đặc biệt chú ý đến đặc điểm này.

- Các dấu hiệu gắn chuỗi poly A của mRNA có trình tự 5’- AAUAAA-3’.

5’ ----------- AAUAAA----------CA-------CA---GU-----3’

Hình 4 - 4. Sơ đồ cấu tạo vùng tín hiệu gắn poly A và tham gia hoạt động của các protein và enzyme polymerase A.

Trước hết nhân tố cắt và đặc thù poly A (CPSF) gắn vào trình tự AAUAAA, sau đó Poly(A)polymerase gắn vào vùng có trình tự CA và cắt bỏ đi một đoạn tính từ sau trình tự CA nhờ sự hỗ trợ của nhân tố kích thích cắt (CstF) gắn vào vùng giầu GU, sau đó protein bọc enzyme polyadenylate rời ra thì poly A được nhập vào chuỗi mRNA.

Vùng này nằm ở ngay trước đầu 3’nơi bắt đầu gắn polyA, dài từ 10 đến 30 nu, tiếp theo là vùng CA, rồi đến vùng giầu GU (hình 4-4). Trình tự vùng tín hiệu gắn poly A và vùng giầu GU là vị trí bọc của nhiều protein lần lượt là yếu tố cắt và gắn polyA (Cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF), nhân tố kích thích cắt (cleavage stimulation factor, CstF), hai nhân tố này hoạt động như là những enzyme endonuclease và ít nhất có thêm 2 yếu tố protein khác nữa cùng phối hợp với CPSF và CstF để cho phép quá trình gắn poly A vào mRNA được tiến hành. Các yếu tố này kết hợp với protein bọc lấy chuỗi polyA giúp enzyme polymerase trùng phân các adenosine và ảnh hưởng đến chiều dài đuôi polyA và duy trì đuôi A sau tổng hợp. Poly A được đính vào tiền mRNA vào lúc sau phiên mã và trước quá trình cắt nối các exon xảy ra.

- Khung đọc mở hay khung đọc mã (open reading frame, ORF):

Phần DNA của gen mã hóa tạo chuỗi polypeptide được gọi là khung đọc mở, bắt đầu bằng một codon khởi đầu AUG hoặc GUG và kết thúc bằng một trong 3 mã kết thúc là UAA/UAG/UGA. Mỗi bộ 3 nucleotide của khung đọc mở tương ứng với một codon mã hóa cho một amino acid. Khung đọc mở được đọc từ đầu 5’ - 3’ dọc theo phân tử mRNA, đọc từng mã một, đọc không chồng chéo và đọc cho đến tận mã kết thúc thì dừng lại.

c. Chức năng của gen

Chức năng của gen thể hiện ở 3 quá trình:

- Tái bản DNA.

- Phiên mã tạo ra mRNA, hoặc rRNA hay

tRNA.

- Dịch mã hoặc sinh tổng hợp protein dựa trên

khuôn mRNA xuyên qua ribosome để lắp ráp

các amino acid nhờ các tRNA vận chuyển đến.

Hình 4 - 5. Sơ đồ hoạt động của gen tạo thành protein enzyme

d. Hoạt động của gen

Một gen đơn vị DNA tái bản, muốn hoạt động trước hết phải sinh ra mRNA, rồi từ mRNA dịch mã thành polypeptide, các polypeptide có thể phải kết hợp lại với nhau mới tạo thành một protein chức năng hay một enzyme, xúc tác cho một công đoạn quyết định hoặc tạo nên tính trạng.

4.2.2. Genome và cấu trúc genome

a. Khái niệm

Genome là một khái niệm dùng để chỉ toàn bộ các gen có trong một giao tử đơn bội có nghĩa là trong giao tử của một loài, mỗi nhiễm sắc thể tương đồng có mặt một chiếc. Lượng DNA của genome có trong một tế bào sinh vật, bao gồm tất cả các gen và các đoạn DNA giữa các gen.

b. Cấu trúc genome

Genome của Eukaryote rất phức tạp về cấu trúc và chức năng. Hầu hết các Eukaryote đều chứa thông tin di truyền nằm trong các tổ chức khác nhau như: nhân, ty thể, lục lạp (có ở các sinh vật quang hợp). Ngoài ra, thông tin di truyền còn có ở trong một số virus, viroid, vi khuẩn sống ký sinh.

+ Genome nhân: Độ lớn tùy vào sinh vật biến động từ 10 Mb - > 100.000 Mb, thường tương quan thuận với tính phức tạp của tổ chức cơ thể. Genome của sinh vật bậc cao thường lớn hơn sinh vật bậc thấp về số lượng gen; lượng DNA lặp lại; thường genome lớn chứa số bản sao các trình tự lặp lại cao.

Bảng 4 - 1. Hàm lượng DNA, số gen và nhiễm sắc thể trong một số sinh vật

Đặc điểm cấu trúc: Genome của nhân được cấu trúc nên từ một bộ các cặp nhiễm sắc thể tương đồng (nhị bội khác so với prokaryote đơn bội). Mỗi nhiễm sắc thể thường chứa một phân tử DNA, trừ nhiễm sắc thể khổng lồ của ruồi dấm và một số vi khuẩn. Genome ở nhân của các loài khác nhau chứa hàm lượng DNA khác nhau. Bộ nhiễm sắc thể trong nhân có số lượng, kích thước và hình dạng xác định khác nhau đặc trưng theo từng loài.

Các loại DNA trong genome nhân:

(1) Loại DNA lặp lại ở mức độ cao: thường chiếm khoảng 10% DNA của mỗi tế bào, là các trình tự ngắn dưới 10 cặp bazơ và có từ 105 – 107 bản sao cho mỗi genome. Những trình tự này thường không mã hoá và thường gắn các vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể như centromere hay telomere. Các tụ điểm (domain) của các DNA lặp lại nhiều lần tạo nên các vùng nhiễm sắc thể đậm đặc khác nhau trong chu kỳ tế bào, so với những vùng khác nhau của nhiễm sắc thể và được gọi là thể dị sắc.

(2) Loại DNA có trình tự lặp lại thấp hoặc trung bình: chiếm khoảng 20%. Loại này chứa các đoạn lặp lại có kích thước lớn hơn (100 cặp bazơ, được lặp lại từ một vài đến hàng ngàn lần và thường xen kẽ với các trình tự chỉ lặp lại một lần dọc theo nhiễm sắc thể. Một số trong chúng có chức năng mã hoá tạo ra rRNA, mRNA hay rRNA 5S. Ví dụ 2 gen tạo histone và RNA ribosome là các gen lặp lại nhiều lần trong genome nhân. Genome nhân của V.faba có khoảng 4750 gen tạo ra rRNA trong khi đó genome của V.sativa chỉ có khoảng 1875.

(3) Loại DNA chứa trình tự duy nhất: chiếm khoảng 70%. Chỉ có một bản và những trình tự này chỉ lặp lại đôi lần, mã hoá cho các protein. Trong hầu hết các cây trồng, chỉ có khoảng 20 - 40% của bộ genome là có chứa trình tự DNA chỉ lặp lại một lần.

+ Genome ty thể: Phần lớn các tế bào. Độ lớn rất biến động và không tương ứng với tính phức tạp của sinh. Genome ty thể động vật thường nhỏ với tổ chức di truyền được gói gọn, các gen sắp xếp sát nhau với ít khoảng trống ở giữa. Genome ty thể ở thực vật lớn hơn genome ty thể ở động vật có vú và nấm enzyme.

Kích thước genome ty thể khác nhau rất lớn giữa các loài. Ví dụ: genome ty thể của Brassica campestris có độ lớn 218 kb, còn của Cucumis melo là 2400 kb, nhỏ hơn nhiêu so với genome nhân.

Tổ chức di truyền của gen ty thể thực vật cũng ít gói gọn hơn và nhiều gen có thể chứa intron.

Số lượng bản sao của genome ty thể còn chưa được biết rõ nhìn chung có từ 5 – 10 genome/ty thể. Mỗi ty thể của người có khoảng 10 phân tử giống nhau (khoảng 8000/tế bào), trong khi ở S. cerevisiae số lượng này là khoảng 6500, gần 100 genome /1 ty thể.

DNA ty thể tồn tại chủ yếu ở dạng mạch vòng kép, đôi khi có xuất hiện dạng mạch thẳng như: nấm enzyme, Paramecium, Chlamydomonas.

Thông tin di truyền trong genome ty thể: genome ty thể chứa các gen mã hóa cho rRNA của ty thể và một số enzyme protein tham gia vào chuỗi hô hấp.

Ngoài ra, ty thể còn chứa các gen mã hóa tRNA, protein ribosome và một số protein khác liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, và vận chuyển các protein khác vào ty thể từ tế bào chất.

Số lượng gen trong ty thể rất biến động, phụ thuộc vào loài: ví dụ ở tảo xanh là 12, ở Arabidopsis thaliana là 52 và ở vi khuẩn Reclinomonas americana là 92.

Bảng 4 - 2. Các gen đã được xác định trong ty thể

Chức năng/ Sản phẩm

Gen

Bộ máy dịch mã

RNA ribosome

rrn5, rrn18, rrn26

Protein ribosome

Bán phân tử nhỏ

Bán phân tử lớn

rps1,rps3, rps7, rps12

rps13, rps14, rps19

rp12, rp15, rp116

RNA vận chuyển

Ít nhất là 16

Các bán phân tử của các chuỗi hô hấp

NADH dehydrogenase

nad1, nad2, nad3, nad4, nad41, nad5, nad6, nad7, nad9

Cytochrome b

Cob

Cytochrome c oxidase

cox I, coxII, coxIII

ATP synthase

atp1, atp16, atp9

Cytochrome c biogenesis

Ít nhất là 4 gen

Khung đọc mã bảo thủ

(conserved open reading frames)

Ít nhất đã biết 10 gen

+ Genome lục lạp: Lục lạp cũng chứa DNA ở dạng các phân tử kép có cấu trúc vòng. Mỗi lục lạp và ty thể đều chứa nhiều phân tử DNA, tuy nhiên mỗi chúng đều chứa các gen giống nhau.

Thông tin di truyền chứa trong genome lục lạp: hầu hết genome của lục lạp có khoảng 200 gen. Các gen này mã hoá cho các RNA ribosome và vận chuyển đồng thời mã hoá cho các protein của ribosome và các protein cần cho hoạt động quang hợp.

+ Genome thể sống ký sinh, ngoài các thành phần genome kể trên có một số tế bào, mô ở một số sinh vật có thể còn có các thể sống ký sinh bên trong. Thể sống ký sinh có thể có lợi nhưng đa phần là có hại đó là virus, viroid, nấm, sán, giun, vi khuẩn…và chúng cũng có genome riêng và cũng có chứa các gen mang thông tin di truyền tạo ra polypeptide. Nếu các gen hoạt động thì cũng biểu hiện hoặc đóng góp vào sự biểu hiện nên tính trạng của sinh vật.

Bảng 4 - 3. Các gen của lục lạp bậc cao và chức năng

Gen

Số Intron

Chức năng

Ghi chú

trnL – UAA

1

tRNA

TrnI - GAU

1

tRNA

TrnA - UGC

1

tRNA

TrnV - UAC

1

tRNA

TrnG - UCC

1

tRNA

TrnK - UUU

1

tRNA

Rps12

3 exon

Protein ribosome

Gắn Trans

AtpF1

1

Bán phân tử của ATP synthase

Rps16

1

Protein ribosome

NdhA

1

Bán phân tử NADH dehydrogenase

NdhB

1

Bán phân tử NADH dehydrogenase

23 Sr ADN

1

23S rRNA

4.3. GEN VÀ GENOME CỦA SINH VẬT TIỀN NHÂN

4.3.1. Cấu trúc gen và genome

Điểm khác so với sinh vật nhân chuẩn là genome sinh vật tiền nhân thường nhỏ, chủ yếu là mạch vòng, hoạt động gen theo kiểu operon, nhiều gen chung một promoter, trong gen không có hoặc có ít intron, không có tín hiệu nhận poly A và mRNA không có đầu 5’ mang mũ 7 methyl Gppp. Chúng thường phải sống ký sinh vào ký chủ, phụ thuộc vào ký chủ và có khả năng tự tái bản độc lập với tế bào ký chủ.

Hình 4 - 6. Cấu trúc gen của operon lactose ở E.coli

Hình 4 - 7. Cấu trúc trình tự promoter của gen sinh vật tiền nhân

4.3.2. Genome của vi khuẩn

DNA của vi khuẩn nằm trong nhiễm sắc thể sơ khai. Phần lớn các vi khuẩn chỉ có một nhiễm sắc thể/tế bào. DNA của vi khuẩn cũng ở dạng vòng, chuỗi kép. Trên DNA có chứa các gen mã hóa cho một protein đặc thù. Ngoài nhiễm sắc thể chính, vi khuẩn còn chứa dạng DNA khác được gọi là plasmid có kích thước bé hơn, dạng vòng, có khả năng tự nhân bản. Các plasmid thường chứa một số gen có tính đặc thù cao.

4.3.3. Genome của virus và plasmid

Virus thường có lượng thông tin di truyền ít hơn nhiều so với sinh vật Eukaryote. Genome của virus có thể là DNA hoặc RNA. DNA của virus có thể là chuỗi đơn (ở thực khuẩn thể) hay chuỗi kép. DNA của virus có cấu trúc đặc biệt ở dạng vòng: hai chuỗi DNA nối cộng hóa trị với nhau tạo thành hình vòng khép kín liên tục, không có đầu 3’ và 5’. DNA của virus gồm hàng nghìn đến hàng chục nghìn nucleotide.

Bảng 4 - 4. Kích cỡ DNA và thể virus (viral particle) của một số thực khuẩn thể

Virus

Độ lớn của DNA virus (bp)

Chiều dài của DNA virus (nm)

Đường kính chiều dài của thể virus (nm)

(X174

5.386

1.939

25

T7

39.936

14.377

78

((lambda)

48.502

17.460

Plasmid

Kích thước plasmid có thể từ một đến 200 Kb. Mỗi plasmid có chứa một trình tự gốc tái bản DNA (ORI). Không có vùng này thì chúng không thể tự nhân lên trong tế bào ký chủ.

Một số plasmid có mặt khoảng từ 10 đến 100 bản sao trong một tế bào ký chủ, đây là những plasmid có số lượng bản sao lớn.

Một số plasmid khác chỉ chứa từ 1 đến 4 bản sao trong một tế bào và được gọi là plasmid có số lượng bản sao thấp.

Lượng DNA plasmid trong một tế bào vi khuẩn rất ít khi vượt quá 0,1 đến 5% DNA tổng số vi khuẩn.

Các dạng Plasmid ở vi khuẩn:

F-plasmid or F factor: mang thông tin di truyền về giới tính của vi khuẩn và có thể được chuyển từ tế bào vi khuẩn này sang tế bào vi khuẩn khác thông qua quá trình tiếp hợp.

R- plasmid: là plasmid mang đặc tính chống chịu với một hoặc nhiều kháng sinh. Chúng bao gồm 2 thành phần: yếu tố chuyền tính kháng (resistant transfer factor, RTF), cần thiết để chuyển plasmid giữa các vi khuẩn và những yếu tố xác định r (r-determinants) là những gen quy định tính kháng kháng sinh, chúng là thành phần của yếu tố di động.

Degradative plasmid: là plasmid phân rã mang các gen đặc hiệu có khả năng sử dụng các chất trao đổi bất thường.

Cryp plasmid: là plasmid tinh thể không mang gen mã hoá bất kỳ chức năng nào.

4.4. DNA CÓ TRÌNH TỰ LẶP LẠI TRONG GENOME

4.4.1. DNA có trình tự lặp lại liền kề (Tandemly repeated DNA)

Các DNA có trình tự lặp lại liền kề hay còn gọi là các DNA vệ tinh. Gọi là các DNA vệ tinh vì các đoạn DNA này có chứa những trình tự DNA được lặp lại liền nhau hình thành nên các băng vệ tinh khi phân tích DNA của genome bằng phương pháp ly tâm chênh lệch tỷ trọng (density gradient centrifugation).

Một genome có thể chứa nhiều loại DNA vệ tinh với đơn vị lặp lại khác nhau. Đơn vị lặp lại của các DNA vệ tinh thay đổi từ vài (<5 bp) đến hàng trăm cặp bazơ (>200 bp). DNA vệ tinh thường tìm thấy ở tâm động hoặc vùng dị nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể. Chúng thuộc nhóm các DNA có trình tự lặp lại cao.

4.4.2. Minisatellite và microsatellite

Minisatellite và microsatellite cũng được gọi là các DNA vệ tinh dù chúng không xuất hiện các băng vệ tinh khi phân tích tỉ trọng DNA.

Minisatellite là các đoạn DNA có nhiều đơn vị lặp lại dưới 25 bp, có chiều dài khoảng 20 kb.

Microsatellite thường dùng để chỉ DNA có đơn vị lặp lại ngắn, thường là 4 bp hoặc ngắn hơn và có chiều dài thường nhỏ hơn 150 bp.

Ví dụ: Motif 5’-TTAGGG-3’ được lặp lại hàng trăm lần ở đầu cuối của NST người là một dạng Minisatellite điển hình, Microsatellite còn được gọi là SSR. Ở cây lúa, các dạng SSR là (GA)n, (GT)n, (AT)n, (GGT)n.

4.4.3. Trình tự lặp lại phân bố rải rác trong genome

a. Khái niệm

Cơ chế phổ biến nhất đối với những trình tự này đó là sự di chuyển vị trí (transposition).

Chính các yếu tố di truyền có khả năng di động (mobile genetic eleenzymets) giữa các vị trí khác nhau trong một hay nhiều genome đã tạo ra các trình tự lặp lại phân bố rải rác trong genome và góp phần làm đa dạng di truyền giữa các cá thể trong loài.

Cơ chế di chuyển: Dựa vào cơ chế di chuyển, các yếu tố có khả năng di động (còn gọi là các yếu tố chuyển vị) có thể xếp thành hai nhóm:

- Nhóm các yếu tố di chuyển thông qua trung gian RNA (RNA transposons hay retroeleenzymets).

- Nhóm các yếu tố di chuyển không qua trung gian RNA là các DNA transposons.

b. Nhóm các yếu tố di chuyển thông qua trung gian RNA (RNA transposons).

Chúng di chuyển thông qua sơ đồ sau:

Hình 4 - 8. Sơ đồ tạo bản sao của Retroposon

Từ đoạn retroposon tổng hợp một bản sao RNA thông qua hoạt động phiên mã, sau đó tổng hợp thành DNA từ bản RNA được phiên mã. Quá trình này có sự tham gia của enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Thường enzyme này được mã hoá bởi gen nằm ngay trong đoạn retroposon.

Bản sao DNA của retroposon được tổ hợp vào genome. Chúng có thể được tổ hợp lại trong cùng một nhiễm sắc thể trên đó đang mang đơn vị lặp lại nguyên thuỷ hoặc cũng có thể được chèn vào một nhiễm sắc thể khác.

Kết quả của quá trình trên sẽ có hai hoặc nhiều bản sao của retroposon ở các vị trí khác nhau trong genome. Thuộc nhóm này gồm các virus sau:

- Retrovirus:

Là những virus có genome là phân tử RNA. Khi xâm nhiễm vào tế bào ký chủ, genome RNA của virus được sao chép thành DNA bởi enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase được mã hoá bởi gen pol của virus, rồi sau đó bản sao DNA được tổ hợp vào genome của tế bào ký chủ, khi đó chúng cùng tái bản với nhiễm sắc thể ký chủ. Tế bào chủ không bị phá hại trừ khi virus mang gen tiền ung thư, sẽ biến tế bào thành tế bào ung thư. Thuộc loại virus mang gen tiền ung thư có virus Rous gây bướu thịt ở chim, virus Maloney và Rauscher gây bệnh bạch cầu ở loài gặm nhấm và gây khối u cho động vật có vú. Nguyên nhân gây bệnh AIDS cho người cũng thuộc loại virus này. Các virus mới có thể được tạo thành bằng việc sao chép đoạn DNA mới được tổ hợp vào genome thành RNA, dịch mã RNA của gen env thành các protein vỏ để bọc gói thành một thể virus hoàn chỉnh, đi xâm nhiễm sang tế bào khác.

Các retrovirus nội sinh: (Endogenous retrovirus, ERVs) là genome của retrovirus khi được tổ hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào ký chủ, chủ yếu là động vật có xương sống. Một số trong chúng vần còn hoạt tính, thậm chí ở một giai đoạn phát triển nào đó của tế bào, chúng có thể tổng hợp nên các virus nội sinh. Tuy nhiên, điều này hầu như không xảy ra. Các trình tự này hầu như không còn hoạt động và được tìm thấy ở nhiều vị trí trong genome. Trong genome của người, những trình tự như vậy có khoảng 1000 bản sao. Phổ biến hơn là những phiên bản được rút ngắn của chúng hay gọi là các yếu tố giống retroviruss (retrovirus-like eleenzymet ), được gọi tắt la RTVLs và có khoảng 20.000 bản trong genome của người.

- Retrotransposon

Là các đoạn có trình tự tương tự như các ERV tuy nhiên chúng được tìm thấy chủ yếu trong các eukaryote như thực vật, nấm và động vật không xương sống. Các retrotransposon thường có số lượng bản sao lớn và tồn tại ở nhiều dạng khác nhau. Ví dụ ở ngô, hầu hết các trình tự lặp lại phân bố rộng trong genome là các retrotransposon và các yếu tố này chiếm đến gần một nửa genome. Nhóm này được chia thành hai nhóm phụ là :

+ Nhóm Ty3/gypsy (Ty3 đặc trưng ở nấm enzyme và gypsy đặc trưng ở ruồi giấm. Nhóm này cũng chứa một nhóm các gen giống như ERV.

+ Nhóm Ty1/copia. Nhóm này thiếu gen env mã hoá protein vỏ của retrovirus. Sự vắng mặt của gen env làm cho chúng không thể hình thành các thể giống với virus ban đầu được ví dụ như:

- Các retroeleenzymet

Các yếu tố lặp lại tận cùng dài (LTRs, long terminal repeats): là những vùng chứa vài trăm cặp bazơ lặp lại, nằm ở đầu các phân tử DNA của retrovirus. LTRs có thể có chức năng làm cơ sở để nhiều gen của sinh vật nhân thật biểu hiện, ví dụ có chức năng kích hoạt, khởi đầu và nhập poly A vào các mRNA Các dạng yếu tố là LTR, LT và poly, chúng đều đóng vai trò quan trọng trong quá trính di chuyển vị trí của chúng trong genome. Kích thước phân tử của các LTR từ dưới vài trăm đến 10 kb.

- Các yếu tố khác không chứa LTR được gọi là retroposon và chúng đặc trưng ở động vật có vú. Nhóm này bao gồm: LINEs và SINEs.

+ LINEs (long interspersed nuclear eleenzymets): Các yếu tố LINE có chứa gen mã hoá cho gag protein và enzyme polymerase có chức năng giống như enzyme phiên mã ngược, Gen mã hoá cho endonuclease env cũng được mã hoá bởi yếu tố này và enzyme này có nhiệm vụ thúc đẩy sự tổ hợp của các yếu tố chuyển vị ‘retro” vào gen. Sự xen đoạn của LINE được lặp đi lặp lại bởi quá trình tái bản trực tiếp và gắn của DNA mục tiêu. Hình 4 - 9 mô tả yếu tố LINE1 của người có chiều dài 6,1 kb và có 3.500 bản sao với độ dài nguyên vẹn. Với các trình tự được rút ngắn hơn thì có tới hàng trăm nghìn bản sao của LINE1 trong tế bào của người.

Hình 4 - 10. So sánh cấu trúc di truyền yếu tố LINE1 và SINE của người

+ SINEs (short interspersed nuclear eleenzymets): Yếu tố này không có gen mã hoá tạo enzyme phiên mã ngược nhưng vẫn có khả năng chuyển vị. Có thể chúng di chuyển bằng cách “mượn” enzyme phiên mã ngược được tổng hợp bởi một retrotransposon khác. SINE có độ lớn từ 100 đến 300 bp. SINE rất phổ biến ở động vật. Ví dụ như chuỗi Alu ở người có mặt tới hàng triệu bản sao. Alu có thể có nguồn gốc từ các gen mã hoá cho 7SL RNA có vai trò điều khiển sự di chuyển của protein xung quanh tế bào. Yếu tố Alu có thể được tạo ra ban đầu bởi quá trình phiên mã ngược ngẫu nhiên của 7SL RNA sau đó DNA tạo ra tái tổ hợp vào genome của người. Do Alu được phiên mã một cách chủ động nên thường xuất hiện một lượng lớn Alu RNA trong tế bào, tạo ra khả năng lớn để khuyếch đại yếu tố này. Trong thực vật SINE tương đối hiếm.

c. Nhóm các yếu tố di chuyển không thông qua RNA (DNA transposons)

Một số yếu tố chuyển vị có khả năng di chuyển một cách trực tiếp hơn mà không cần qua trung gian RNA. Chúng di chuyển bằng cách cắt và tổ hợp trực tiếp cấc đoạn DNA. Có hai cơ chế giải thích cho sự chuyển vị của các yếu tố này, đó là:

+Sự di chuyển có tính tự tái bản (replicative transposition): Phiên bản của các yếu tố chuyển vị được sao chép từ vị trí ban đầu và tái tổ hợp vào vị trí mới mục tiêu. Sau mỗi lần di chuyển thì số lượng bản sao được tăng lên.

+ Sự di chuyển có tính bảo thủ (conservative transposition) các yếu tố chuyển vị có thể tách ra khỏi vị trí ban đầu và sau đó là tái tổ hợp lại ở một vị trí mới. Trong trường hợp này, số lượng của các transposon là không thay đổi.

Hình 4 - 11. Cơ chế chuyển vị các DNA transposon

d. Cấu trúc Ac và Ds ở ngô

Ac là yếu tố di động. Ac có độ dài 4563 bp, được giới hạn hai đầu bởi hai IR có chiều dài 11 bp, trình tự ngược chiều nhau. Yếu tố Ac mã hoá cho một mRNA có độ dài 3.5 kb, có một đầu 5’ UTR 650 bazơ (UTR – vùng không dịch mã- untranslated region) và một khung đọc mở dịch mã tạo một protein có 807 amino acid, enzyme transposase, là enzyme xúc tác cho quá trình gắn xen của các transposon. Đoạn Ac có chứa 4 intron (a,b,c,d) và chia trình tự đó thành 5 exon.

Ds: là yếu tố nhảy có nguồn gốc từ Ac bị đột biến mất đoạn, có trình tự hai đầu là IR giống hệt Ac. Hầu hết các Ds đều có tính tương đồng với Ac nhưng thường ngắn hơn, do đột biến mất đoạn. Hiện đã phát hiện thấy một số loaị Ds ở ngô.

Các yếu tố Ds không có đoạn ORF đầy đủ, nên không tạo được enzyme transposase, vì thế không tự di chuyển được. Ds có thể di chuyển được nếu Ac cùng có mặt trong genome vì Ac sinh ra enzyme transposase giúp dịch chuyển các yếu tố Ds.

Hình 4 - 12. So sánh cấu trúc yếu tố Ac với Ds ở ngô do mất đoạn

4.5. DNA TRANSPOSON CỦA PROKARYOTE

4.5.1. Các yếu tố di động của prokaryote

+ Yếu tố IS

Enzyme resolvase là enzyme xúc tác cho quá trình tái tổ hợp đặc thù vị trí giữa 2 transposon tồn tại trình tự lặp lại trực tiếp trong cấu trúc đồng kết gắn.

+ Transposon Tn: Composite transposon: Yếu tố này về cơ bản chính là một đoạn DNA có gắn đoạn IS ở hai đầu và mang 1 hoặc vài gen thường mã hoá cho khả năng kháng lại kháng sinh. Sự chuyển vị của composite transposon được hoạt hoá bởi enzyme transposase mã hoá bởi 1 hoặc cả hai đoạn IS ở hai đầu. Yếu tố thuộc nhóm này chuyển vị theo cơ chế bảo thủ.

+ IS (insertion sequence) hay các trình tự đoạn gắn xen: Các IS là những đơn vị độc lập, chúng chỉ mã hoá cho một hoặc hai gen mã hoá cho enzyme transposase cần thiết cho sự chuyển vị của chúng. Ở E. coli, người ta tìm thấy khoảng 20 yếu tố IS với các dạng khác nhau. Điển hình là yếu tố IS1, IS2 và IS10R. IS1 có chiều dài 786bp với 4 -9 bản sao trên nhiễm sắc thể của E.coli.

Hình 4 - 13. Sơ đồ quá trình tổ hợp của nguyên tố IS vào DNA nhiễm sắc thể

4.5.2. Đặc điểm của yếu tố IS

IS2 có từ 0 - 12 bản sao trên nhiễm sắc thể của E coli và một bản trên plasmid F. Nguyên tố IS10R được tìm thấy trên các R plasmid.

Trong prokaryote, các IS có kích thước thay đổi từ 768 bp đến 5000 bp và chiếm khoảng 0,3% hệ gen của prokaryote.

Cơ chế chuyển vị của IS: Các IS có thể chuyển vị theo cả cơ chế tái bản và bảo thủ. Chúng chèn vào nhiễm sắc thể ở những vị trí có tính ngẫu nhiên, gây ra đột biến thông qua hoạt động xáo trộn trình tự mã di truyền của một gen hay làm xáo trộn vùng điều hoà hoạt động của gen.

Những promoter nằm trong các IS có thể gây ảnh hưởng làm thay đổi sự biểu hiện của gen kế cận. Khi chuyển vị theo cơ chế tái bản, sự tái bản chính xác của IS nguyên thuỷ là cần thiết. Enzyme transposase nhận biết các trình tự IR (inverted repeat) của IS để khởi động tiến trình chuyển vị.

Tần suất chuyển vị của mối IS là từ 10-5 - 10 -7 trong mỗi thế hệ.

4.5.3. Yếu tố di động

Non composite transposon hay Tn3-type transposon. Yếu tố này có gen chuyển vị riêng vì thê không cần yếu tố xen (đoạn IS) để chuyển vị. Sự chuyển vị của yếu tố Tn có tính tự tái bản.

Transposable phage: Là virus ký sinh trong vi khuẩn. Sự di chuyển của chúng có tính tái bản như một phần trong một chu kỳ lây nhiễm bình thường của chúng.

Ví dụ điển hình cho nhóm này là thực khuẩn thể Mu. Cũng như các thực khuẩn thể λ, phage Mu có khả năng hoạt động trong chu kỳ phân giải hoặc xâm nhập vào pha phân giải (lysogenic phase). Mu chuyển vị theo cơ chế tự tái bản và gây ra sự kiện đột biến. Chính vì thể Mu là viết tắt của ‘mutator’ tức là thể gây đột biến. Trong Phage, Mu là một đoạn DNA thẳng có độ lớn khoảng 37 kb chứa các gen có liên quan đến quá trình di chuyển và các gen mã hoá cho các protein cấu trúc có chức năng đóng gói DNA để tạo thành thể phage mới.

Thực khuẩn thể Mu: Giống như các transposon khác, Mu có giới hạn ở hai đầu bởi các đoạn nucleotide lặp lại ngược chiều (IR) và chúng tạo ra các đoạn ngắn lặp lại cùng chiều dài 5 bp của genome vật chủ tại vị trí ghép vào. Đáng chú ý là khi đóng gói tạo thể phage mới, hai đầu của Mu luôn có các đoạn DNA của vi khuẩn tại vị trí mà Mu ghép vào. Các đoạn này sẽ được phân huỷ khi Mu tiếp tục sự xâm nhiễm của mình.

Hình 4 - 14. Sự di chuyển của thực khuẩn thể Mu theo cơ chế tự tái bản

4.6. TỔ CHỨC HỆ GENOME CỦA NGƯỜI

Genome của người dài khoảng 3200Mb, 1/3 DNA trong đó có liên quan đến gen. Trong DNA của một gen lại bao gồm vùng mã hóa và không mã hóa, vùng không mã hóa lại bao gồm Pseudogene, các đoạn trong gen, các intron và vùng leader. Theo Strachan & Read (1996) thì Pseudogene là gen rất giống với một gen đã biết ở locus khác nhưng không có chức năng do đột biến thêm hoặc mất một cấu trúc làm mất khả năng phiên hoặc dịch mã gen. Còn phần lớn các DNA còn lại (chiếm 2/3) là trình tự DNA giữa các gen gồm trình tự lặp lại (420 Mb): liền kề và phân bố rải rác. Trong trình tự lặp lại liền kề lại bao gồm trình tự DNA satellite, microsatellite và minisatellite. Còn trình tự phân bố rải rác bao gồm các LTRs, SINE, LINE và DNA transposon. Trình tự linh tinh khác (miscellaneous) chiếm 25% gồm: SD (Shine-Dalgano Sequence) là một phần hoặc tất cả trình tự vùng leader của mRNA vi khuẩn AGGAGG nằm trước codon khởi đầu AUG, trình tự này bổ sung với đầu 3 của 16S rRNA vì thế là vị trí bọc của ribosome. Vùng 16S rRNA này theo Shine và Dalgano (1974) có thể đóng vai trò ghép cặp bazơ trong việc kết thúc và khởi đầu quá trình tổng hợp protein của mRNA. SSR (Simple sequence repeats) trình tự lặp lại đơn giản nằm rải rắc trong genome. Số còn lại 17% DNA genome đến nay vẫn chưa rõ thuộc loại cấu trúc nào. Mô hình sau đây minh họa tỷ lệ % DNA giữa các thành phần trong hệ genome nhân của người đã được phát hiện.

Hình 4 - 15. Các thành phần của genome người

Hình 4 - 16. Tổ chức hệ genome của người

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Gen là gì, cấu tạo, sự giống và khác nhau giữa prokaryote và eukaryote. Khung đọc mở là gì, có thể thay đổi được không.

2. Chức năng của gen, sự khác nhau giữa hai sinh vật prokaryote và eukaryote. Có thể xác định được số lượng gen trong genome sinh vật được không.

3. Genome là gì, thành phần, điểm giống và khác nhau giữa prokaryote và eukaryote.

4. Genome ty thể, lạp thể và thể sống ký sinh trong tế bào nhân thật khác so với genome nhân như thế nào.

5. Genome sinh vật prokaryote, vi khuẩn, virus và plasmid. Retrovirus là gì, cơ chế xâm nhiễm virus HIV.

6. Trình tự lặp lại, liền kề, Minisatellite, Microsatellite và phân bố rải rác. Cơ chế di động của trình tự lặp lại và virus nội sinh ở sinh vật.

7. Nêu đặc điểm cấu trúc một số yếu tố di động AC, Ds, Alu, IS, Tn và thực khuẩn thể Mu.

8. Nêu thành phần và cấu trúc genome nhân của người. Pseudogene, trình tự SD và SSR là gì?

Chương 5 TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA DNA

Để đảm nhiệm chức năng mang và truyền thông tin di truyền một cách chính xác và ổn định từ tế bào này sang tế bào khác, từ thế hệ này sang thế hệ khác nhưng đồng thời phải cósự biến đổi để tiến hóa và thích nghi thì DNA cần phải có một số đặc tính nhất định đó là: tái bản, sửa sai và đột biến.

Trong chu trình sinh trưởng và phát triển, tế bào chỉ tiến hành phân chia sau khi DNA được nhân đôi, để ổn định lượng DNA trong mọi tế bào. Quá trình này gọi là sự tái bản DNA, kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sau một lần tái bản sẽ tạo thành 2 phân tử DNA con giống hệt nhau và giống hệt với phân tử ban đầu.

Tuy nhiên trong quá trình tái bản cũng có thể xẩy ra những sai sót. Để đảm bảo cho việc lưu trữ và truyền đạt thông di truyền một cách trung thành từ tế bào này sang tế bào khác thì tế bào phải tự trang bị cho mình một hệ thống bảo vệ và sửa chữa các sai lầm trong quá trình tái bản gặp phải.

Mặc dù vậy ít nhiều cũng có quá trình biến đổi xảy ra tạo cơ sở cho tiến hóa của sinh giới. Biến đổi này do đột biến gen, do gen nhảy hay do tái tổ hợp di truyền trên phân tử DNA.

5.1. QUÁ TRÌNH TÁI BẢN DNA

5.1.1. Ở prokaryote

a. Nguyên tắc bán bảo thủ

Sự tái bản DNA được thực hiện theo nguyên lý bán bảo toàn (semiconservative) do Watson và Crick đề xuất (1953) dựa trên cơ sở tính đặc thù liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung của 2 mạch đơn. Hãy tưởng tượng sợi DNA kép giống như một cái khoá dây xéc măng tuya, 2 dây tách rời nhau từ một đầu, mỗi dây là một mạch đơn được dùng làm khuôn để tổng hợp thêm mạch đơn mới trên cơ sở nguyên lí ghép cặp bổ sung giữa các bazơ, kết quả tạo ra 2 phân tử DNA trong đó mỗi phân tử có một mạch đơn cũ và một mạch đơn mới.

Chứng minh cho điều này là thí nghiệm của 2 nhà khoa học trẻ M. Meselson và F. Stahl tiến hành vào năm 1958. Họ đã nuôi vi khuẩn E.coli trong môi trường chỉ có nguồn N nặng đánh dấu phóng xạ N15. Các N15 được nhập vào các bazơ nitơ của nucleotide, khi tái bản vi khuẩn sẽ phải sử dụng để tổng hợp sợi DNA, qua một số thế hệ tính theo thời gian nuôi sẽ tạo ra toàn bộ DNA có chứa N15 này. Sau đó nếu đưa vi khuẩn vào môi trường chứa N14 nhẹ, thì vi khuẩn sẽ phải lấy nguồn nitơ nhẹ để tổng hợp, qua lần tái bản thứ 2 sẽ có một nửa số sợi đơn (ban đầu) còn sợi đơn kia mang nitơ nhẹ. Quay li tâm trong ống gradient tỷ trọng khác nhau chứa chất cesium chloride (CsCl2) sẽ phân tách DNA nặng (H) và nhẹ (L), kết quả sẽ thu được các vạch trên ống tỷ trọng, chứng tỏ quá trình tái bản theo phương thức bán bảo thủ (hình 5 - 1 và 5 - 2).

Hình 5 - 1. Sơ đồ sử dụng phương pháp li tâm các DNA tái bản được đánh dấu N15 trong

nền dung dịch CsCl2 tạo tỷ trọng tăng dần

(nhằm chứng minh quá trình tổng hợp DNA theo nguyên tắc bán bảo thủ)

Hình 5 - 2. Sơ đồ chứng minh cơ chế tổng hợp DNA E.coli theo nguyên tắc bán bảo toàn.

Thế hệ đầu các bazơ đánh dấu của DNA E.coli chứa toàn bộ N15 , sau đó E.coli đó được nuôi trong môi trường chứa các nu có N14 bình thường, theo thế hệ DNA được tổng hợp sẽ nhẹ dần nhờ sử dụng các bazơ chứa N14 , các bazơ này sẽ thay thế dần N15 làm DNA nhẹ dần đi.

b. Quá trình tái bản khởi đầu bằng sự tháo xoắn

Trong tự nhiên có 3 mô hình cấu tạo phân tử DNA tồn tại, dạng 1: siêu xoắn, dạng 2: xoắn (vòng) và dạng 3: thẳng ở sinh vật nhân thật bậc cao . DNA vòng, ở sinh vật tiền nhân, chúng có thể ở trạng thái xoắn và siêu xoắn, khi tái bản thường bắt đầu từ việc đứt tại một điểm của một trong 2 mạch đơn DNA. Còn dạng thẳng thì cũng bắt đầu cắt đứt ở 1 điểm nhưng đứt ở cả hai mạch đơn và có thể đứt ở nhiều vị trí khác nhau trên một nhiễm sắc thể. Vị trí đứt khởi đầu tái bản thường nằm ở những vùng DNA có chứa nhiều trình tự AT, dài từ 100 đến 200bp. Tiếp đến là quá trình tháo xoắn do nhiều enzyme tham gia có tên gọi là topoisomerase, enzyme này có 2 loại là: topoisomerase I tháo xoắn dạng DNA siêu xoắn, chúng gắn vào DNA và cắt một trong 2 sợi, sau khi tạo được sợi DNA tháo xoắn thì enzyme này nối chỗ đứt lại, điển hình của enzyme này là protein ( của E.coli.

Topoisomerase II cắt cả 2 mạch của phân tử DNA, thí dụ như enzyme gyrase của E.coli thuộc loại này. Sau khi tháo xoắn tạo ra DNA thẳng thì các enzyme này lại có nhiệm vụ tự nối các vị trí vừa cắt lại. Kết quả của quá trình tháo xoắn đã tạo lên chạc tái bản, sẵn sàng cho quá trình tổng hợp sợi đơn mới. Sơ đồ chạc 3 tái bản DNA (hình 5 - 3).

Hình 5 - 3. Sơ đồ quá trình tái bản DNA theo Okazaki (1968)

c. Quá trình tái bản là một cơ chế sinh hóa phức tạp có sự tham gia bởi nhiều nhân tố

Ở nhiễm sắc thể vòng của vi khuẩn, quá trình tái bản bắt đầu từ một điểm sau đó lan ra theo 2 hướng đến khi đụng vào nhau ở điểm nối đối diện, tạo thành 2 nhiễm sắc thể vòng xoắn. Quá trình tái bản đòi hỏi sự tham gia của nhiều protein khác nhau. E.coli cần ít nhất 2 tá sản phẩm gen khác nhau (bảng 5 - 1).

Ở sinh vật nhân chuẩn do kích thước sợi DNA quá lớn và có nhiều sợi nên quá trình tái bản không chỉ từ 1 điểm mà bắt đầu từ nhiều điểm. Thí dụ ở người có từ 20.000 đến 30.000 điểm, đây gọi là đơn vị tái bản. Đơn vị tái bản là vùng DNA được tái bản từ 1 điểm khởi đầu được gọi là replicon, chiều dài một replicon ở người từ 100 đến 200 kb. Mỗi nhiễm sắc thể của một vi khuẩn là một replicon. Mỗi nhiễm sắc thể có nhiều replicon và tái bản từ điểm khởi đầu cũng theo 2 hướng tái bản đến 2 đoạn DNA cuối.

Hai mạch đơn của phân tử DNA được tách rời nhau nhờ những enzyme gọi là helicase hay còn gọi là deroulase, ở E.coli có 2 helicase. Enzyme này phá vỡ liên kết hydro giữa các bazơ trên 2 sợi đơn bổ sung, giúp chúng xoắn kép vào nhau. Có nhiều loại helicase cùng đồng thời hoạt động, một số gắn trên mạch theo hướng 3’-5’ như (các protein của gen Rep), một số khác gắn trên mạch theo hướng 5’-3’ như helicase II và III. Các mạch đơn sau đó tách rời nhau một cách ổn định là nhờ các protein SSB (single strand binding proteins, SSBPs). Những protein này gắn lên khắp các nơi của mạch đơn đang được kéo dài làm 2 mạch đơn không kết hợp lại với nhau. Nhờ vậy mà tốc độ tái bản tăng lên hàng 100 lần so với ngoài cơ thể khi không có SSB trợ giúp.

Cả 2 mạch đơn đều có thể được dùng làm khuôn để tổng hợp lên sợi DNA mới tuỳ theo vị trí của promoter. Nếu promoter đặt ở đầu 5’ của sợi DNA thì tổng hợp sẽ theo hướng từ mạch đơn đầu 3’ nguyên bản (leading strand) sẽ tiến hành tổng hợp liên tục, còn mạch nguyên bản kia từ đầu 5’ sẽ tổng hợp đứt đoạn theo từng đoạn Okazaki.

d. Tái bản bắt đầu từ việc tổng hợp mồi (primer) RNA

Sợi đơn DNA mới được tổng hợp bắt đầu từ đoạn RNA mồi, việc tổng hợp RNA mồi do enzyme có tên là primase tiến hành. Mồi RNA là một chuỗi RNA ngắn chứa 8 – 12 nucleotide. Để enzyme này hoạt động được cần phải hình thành được một phức hợp giữa enzyme primase với ít nhất là 6 protein khác nhau. Phức hợp này gọi là primosome. Ngoài enzyme primase, primosome còn chứa những protein tiền tạo mồi đặt tên là protein i, n, n’ và n’’ cộng thêm sản phẩm của những gen dna B và dna C (bảng 5 - 1).

Primosome tiến hành phản ứng sinh mồi đầu tiên cho sợi tiến (leading) và tổng hợp mồi lặp lại để tổng hợp những đoạn Okazaki cho mạch lùi (lagging). Tuy nhiên chức năng của mỗi protein trong primosome vẫn chưa rõ.

Hình 5 - 4. Thành phần và cấu trúc của enzyme DNA polymerase III

Tham gia tổng hợp DNA ở vi khuẩn có 2 enzyme DNA polymerase là DNA polymerase I và III. Enzyme tổng hợp kéo dài sợi mới trong quá trình sao chép nhiễm sắc thể ở E.coli là enzyme DNA polymerase III.

DNA polymerase I chỉ chứa một chuỗi polypeptide, trong khi đó DNA polymerase III hình 5.4) là một holoenzyme phức chứa 7 polypeptide khác nhau (α, β, 2γ, δ, ε, µ, 2θ), toàn bộ đều có vai trò giúp cho quá trình tái bản DNA được chính xác, với sai sót rất thấp chỉ bằng 10-10, tức cứ 10 tỷ bazơ nhập vào chuỗi thì chỉ sai có một bazơ. Điều này là do cả DNA pol I và III đều có chức năng đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease (proofreading). Hoạt tính tổng hợp và phân rã theo hướng 5’ - 3’, cả 2 đặc tính này đều có ở polypeptide ( của DNA polymerase III. Hoạt tính đọc sửa do polypeptide ( đảm nhận. Còn chức năng các tiểu đơn vị khác vẫn chưa rõ.

e. Sự tổng hợp hai mạch đơn mới xảy ra liên tục trên mạch bổ sung với sợi leading và gián đoạn trên sợi lagging

- Enzyme DNA polymerase III tổng hợp mạch bổ sung từ đầu 3’OH tự do của mỗi mồi RNA.

- Mạch khuôn được sử dụng đến đâu các protein SSB được giải phóng ra đến đó.

- Vì chiều tổng hợp DNA luôn từ hướng 5’-3’, cho nên sự hình thành chuỗi polynucleotide mới trên 2 mạch khuôn diễn ra theo 2 hướng ngược chiều nhau.

- Trên mạch khuôn hướng 3’-5’, sinh tổng hợp mạch đơn mới diễn ra theo chiều cùng hướng với hướng tháo xoắn, mạch này được tổng hợp liên tục được gọi là mạch tiến.

- Trên mạch khuôn 5’-3’ sinh tổng hợp mạch đơn mới diễn ra theo hướng ngược với hướng tháo xoắn, xẩy ra không liên tục mà dưới dạng những đoạn ngắn gọi là đoạn Okazaki (kích thước mỗi đoạn dài từ 1000 đến 2000 bp) mạch này được gọi là mạch chậm hay lùi. Tuy nhiên, theo CA. Wu và cộng sự năm 1992. (J. Biol. Chem. Vol. 276. issue 6, 4074 - 4083, 02. 1992), thì kích thước đoạn Okazaki ở E.coli dài ngắn còn phụ thuộc vào nồng độ NTPs hoặc enzyme primase và điều kiện môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mồi trên sợi lùi. Nếu lượng Pol. III ít kết hợp với primase thấp thì đoạn Okazaki có thể dài hơn 7 kb.

f. Quá trình hoàn chỉnh sợi mới tổng hợp

- Sau khi tái bản kết thúc, các mồi RNA bị phân rã bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của DNA pol I,để lại các lỗ hổng, sau đó các lỗ hổng này được lấp đầy nhờ chính enzyme DNA polymerase I, enzyme này kết hợp với đầu 3’ của các đoạn Okazaki rồi tổng hợp sợi đơn DNA thay thế vị trí mồi RNA.

- Tiếp theo enzyme ligase sẽ nối tất cả các chỗ gián đoạn trên mạch mới.

- E.coli chứa khoảng 5 triệu bp, cần 40 phút để tái bản xong toàn bô genome. Vi khuẩn tái bản theo phương thức vòng lăn, một nhiễm sắc thể vòng có 2 chạc tái bản xẩy ra đồng thời, như vậy tốc độ tái bản trung bình của vi khuẩn là khoảng 1000 bazơ trong một giây. Tốc độ này khá cao là do Polymerase III chứa 2 tâm xúc tác có khả năng tổng hợp đồng thời cùng một lúc trên cả 2 mạch tiến và lùi với tốc độ cao, là do được kết hợp với protein β, giúp pol. III gắn vào DNA nguyên bản và chuyển từ một enzyme có tính liên tục thấp (cứ thêm 10 bazơ lại tách rời nguyên bản) thành một enzyme có tính liên tục cao, có thể kéo dài liên tục hàng 10 ngàn bazơ.

5.1.2. Tái bản DNA ở Eukaryote

a. Thành phần tham gia

Cơ chế tái bản ở sinh vật nhân chuẩn cũng giống như sinh vật tiền nhân theo cơ chế bán bảo thủ, có một sợi tiến và một sợi lùi (quá trình tái bản chưa được hiểu rõ). Tuy nhiên bằng nhiều dữ liệu cho thấy chúng cũng có cơ chế tương tự như ở sinh vật tiền nhân. Điều khác biệt chủ yếu có thể là thời gian hoàn thành một chu kỳ phân chia tái bản genome, biến động từ 1,4 giờ đối với nấm men (có16 nhiễm sắc thể) đến 24 giờ ở một số tế bào động vật nuôi cấy mô, thậm chí có tế bào kéo dài từ 100 đến 200 giờ. Khác biệt nữa là ở thành phần tham gia vào bộ máy tổng hợp. Nếu ở E. coli có 13 thành phần thì ở nấm men và động vật có vú có ít nhất là 27 thành phần. Lý do cần nhiều thành phần là do độ phức tạp của DNA bậc cao, chúng được tổ chức trong các nucleosome (histone bọc DNA). Có nhiều loại DNA polymerase tham gia vào quá trình sao chép là:

- Polymerase (/primase có chức năng tổng hợp mồi RNA cho mạch chậm, enzyme này không có khả năng sửa sai (exonuclease) do đó không phải là thành phần duy nhất tham gia vào quá trình tái bản.

- Polymerase ( có chức năng giống DNA polymerase I ở sinh vật tiền nhân, nghĩa là có đặc tính vừa tổng hợp đi liền với sửa chữa và hoàn chỉnh sợi đơn DNA sau khi mồi RNA được loại bỏ.

- Polymerase ( được tìm thấy ở ty thể có chức năng chưa rõ.

- Polymerase ( dường như có chức năng gần với DNA polymerase III ở sinh vật tiền nhân.

- Polymerase ( mới được phát hiện gần đây có vai trò chưa rõ.

Ngoài các enzyme kể trên hệ thống tái bản ở sinh vật nhân chuẩn còn có sự tham gia của nhiều protein chuyên biệt như nhân tố kết gắn nhiễm sắc CAF-1. Nhân tố này kết hợp và mang một số histone mới được tổng hợp đến chạc tái bản, ở đây chúng kết hợp tiếp với protein β tạo thành một tổ chức lắp ghép trung gian có tên là PCNA (proliferating cell nuclease antigen: kháng nguyên nhân tế bào đang phân chia). Phức hợp protein này làm nhiệm vụ tháo bỏ và lắp ghép lại các protein nằm trong nucleosome để giúp quá trình tái bản và tân tạo lại các nucleosome mới thông qua việc hoạt hóa các polymerase ( và ( và các nhân tố sao chép A và C (Replication Factor, RF-A, RF-C) cần cho hoạt động của các DNA polymerase ( và (.

Đoạn khởi đầu tái bản dài từ hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn bp, cũng giầu AT và có nhiều điểm khởi đầu trên một nhiễm sắc thể và trong genome. Từ các điểm này DNA cũng được tổng hợp về cả 2 hướng.

b . Mô hình tái bản ở sinh vật nhân chuẩn được đề xuất như sau:

- Đầu tiên, phức hợp nhận biết vùng khởi đầu tái bản (origin recognition complex, ORC) bọc lấy những điểm khởi đầu, dưới tác dụng của enzyme topoisomerase và nhân tố tái bản (RF-A) làm DNA được tháo xoắn.

- Trên mạch chậm, polymerase (/primase tương tác với RF-A để tổng hợp lên các mồi RNA dài độ 10 nucleotide, mồi này sau đó được nối dài thêm 20 deoxynuleotide nữa nhờ enzyme polymerase ( kết hợp với nhân tố sao chép C (RF-C). Khi đó phức hợp PCNA-ATP đã chặn polymerase ( lại, để cho phép enzyme polymerase ( gắn vào chuỗi và tổng hợp đoạn Okazaki.

- Enzyme polymerase ( sau khi được giải phóng sẽ chuyển đến mạch đối diện và tổng hợp liên tục mạch tiến.

- Vấn đề đối với sinh vật nhân chuẩn là có quá trình hình thành cấu trúc nhiễm sắc chất. Nhiều nghiên cứu sử dụng đồng vị phóng xạ cho thấy các phân tử DNA ngay sau khi được sao chép đã tổ chức lại ngay thành các nucleosome trong vòng vài phút. Các nucleosome mới hình thành chỉ chứa các histone mới tổng hợp, vậy nucleosome mới hình thành này nằm hoàn toàn trên một mạch còn nucleosome cũ trên mạch kia hay chúng phân bố đều trên cả hai mạch thì vẫn chưa rõ.

c. Kết thúc tổng hợp tại đầu telomere của mỗi nhiễm sắc thể

Tại đây ở mạch tiến sợi đơn mới được kéo dài từ điểm khởi đầu đến hết đầu mút nhiễm sắc, riêng đối với mạch lùi thì có hiện tượng còn một đọan kết thúc trống chưa chạm đến đầu mút 3’ kia. Làm thế nào để khi hoàn chỉnh sợi DNA kép mới, đoạn này không bị mất đi, muốn thế tế bào phải có một cơ chế chống lại nguy cơ mất này.

Hình 5 - 5. Quá trình tái bản mỗi đoạn Okazaki trên sợi lùi kết quả sẽ tạo ra đầu 3’ nguyên bản cheo.

Sợi mới tổng hợp có màu vàng, sợi nguyên bản màu xanh.

Năm 1978, E. Blackburn và J. Gall đã phát hiện ở các đầu telomere có chứa nhiều đoạn lặp lại giống nhau. Đầu cuối của các đọan DNA ở đầu nhiễm sắc thể, nơi sinh ra rRNA chứa một dẫy ngẫu nhiên gồm nhiều đoạn lặp lại TTGGGG. Đặc điểm này có ở hầu hết các nhiễm sắc thể của sinh vật nhân chuẩn. Tuy nhiên trình tự lặp lại của các loài khác nhau có khác nhau. Thí dụ như ở đầu cuối các nhiễm sắc thể của người dài 10 – 15 kb chứa nhiều đoạn lặp lại TTAGGG. Để không bị mất đoạn DNA telomere ở đầu 3’ thì cần có một enzyme có tên là telomerase để gắn thêm những đoạn 3’ AACCCCAAC 5’ vào đầu 3’ của DNA telomere, bổ sung với đoạn lặp lại.

Sau khi thêm 3’ AACCCCAAC 5’ vào đầu cheo 3’, enzyme telomerase RNA sẽ di chuyển dọc theo phân tử DNA (sang phải) vì thế đầu 3’ có thể kéo dài thêm nhờ hoạt tính trùng phân. Đầu 3’ tiếp tục được kéo dài do sự di chuyển tiếp tục của enzyme RNA telomerase. Sau đó, enzyme primase, xúc tác tạo mồi 3’AAC 5’ và DNA polymerase sử dụng đầu 3’ cheo rất dài này làm nguyên bản để lấp đầy đầu cuối cho mạch đơn DNA kia. Cuối cùng mồi bị loại bỏ và ligase sẽ nối chỗ trống lại. Kết quả giữ nguyên được chiều dài của nhiễm sắc thể qua mỗi lần tái bản.

.

Hình 5 - 6. Cơ chế kéo dài đầu telomere nhờ enzyme telomerase mang phân tử RNA ngắn làm mồi

d. Telomere, bệnh ung thư và cơ chế già hoá

Để tránh mất vật liệu di truyền sau mỗi lần tái bản, telomere cần phải kết hợp với một số protein để hình thành lên mũ bảo vệ. Cấu tạo của mũ bảo vệ telomere (hình 5-8) gồm 3 protein là TRF1, TRF2 và WRN, chúng liên kết với nhau rồi bọc lấy những trình tự lặp lại ở telomere, ẩn dấu đầu cheo 3’, đoạn này nhiều khi dài đến 100 bazơ. Mũ bảo vệ ở telomere có 3 chức năng: 1) ngăn cản không cho enzyme deoxyribonuclease phân giải đầu mut cua phân tử DNA, 2) ngăn cản không cho các nhiễm sắc thể trong nhân dính vào nhau, 3) tạo sự ổn định trong quá trình tái bản DNA ở phần cuối nhiễm sắc thể. Nếu không có mũ bảo vệ telomere thì đầu cuối sợi nhiễm sắc thể sẽ bị gẫy, dẫn đến làm nhiễm sắc thể không ổn định và dần ngắn lại qua mỗi lần tái bản, là nguyên nhân gây ra bệnh ung thư và nhiều bệnh khác liên quan đến quá trình già hoá.

Hình 5 - 7. Mũ bảo vệ đầu telomere của nhiễm sắc thể bởi protein TRF1, TRF2 bọc lấy trình tự lặp lại còn protein WRN lại bọc lấy 2 protein trên, tạo thành cấu trúc che dấu đầu telomere.

Hầu hết các tế bào mầm có rất nhiều enzyme telomerase, trong khi đó tế bào soma lại tạo ra rất ít hoặc không có telomerase. Vì thế, có thể nhiễm sắc thể của tế bào đang phân hoá sẽ dần ngắn lại sau mỗi lần phân chia tế bào đến khi kết thúc phân chia và đến pha già hoá. Bởi vậy các nhà khoa học cho rằng có một liên quan giữa việc telomere bị ngắn dần đi cùng với tuổi già. Người bị những bệnh già trước tuổi (Werner syndrome) biểu hiện da nhăn nheo, đục nhân mắt, loãng xương, tóc bạc sớm và hay bị bệnh tim mạch. Người bệnh này khi phân tích cho thấy có các telomere trên các đầu nhiễm sắc thể thường ngắn hơn so với người bình thường, người bệnh chứa gen đột biến WRN, mất khả năng tổng hợp một enzyme helicase, enzyme này là thành phần không thể thiếu được của mũ telomere.

Người ta còn phát hiện thấy có mối liên quan giữa telomere với bệnh ung thư. Ngược lại với tế bào soma, hầu hết các tế bào ung thư đều sản sinh ra nhiều enzyme telomerase hoạt động. Khả năng duy trì telomerase chức năng có thể là lí do gây lên bệnh ung thư. Vì thế nhiều công ty dược liệu đã đầu tư kinh phí để nghiên cứu sự khác nhau giữa tế bào ung thư và tế bào thường và đề xuất giải pháp dùng hoá chất nào đó tác động có chọn lọc vào tế bào ung thư, hóa chất này có khả năng ức chế hoạt động của enzyme telomerase trong tế bào ung thư thì sẽ có thể điều trị được bệnh này.

5.2. HỆ THỐNG SỬA CHỮA SAI SÓT KHI TÁI BẢN DNA

5.2.1. Cơ chế phòng ngừa

Tế bào có những hệ thống ngăn chặn tác hại có thể có của nhiều chất chuyển hóa trong tế bào, hay từ bên ngoài xâm nhập vào như: enzyme superoxide dismustase phân hủy các ion superoxide nguy hiểm, các ion H+ chịu tác động của các hệ thống điều hòa cân bằng acid- bazơ. Các phản ứng oxy hóa sẽ được khử bởi các hệ thống khử NADPH,H+, glutathion và vitamin E. Ngoài ra ở sinh vật đa bào việc khử độc và loại bỏ nhiều hóa chất gây độc được tiến hành bởi gan và thận. Hiện người ta đã biết có đên hành trăm protein tham gia vào quá trình sửa sai DNA.

5.2.2. Các cơ chế đảm bảo sự trung thành trong tái bản

Cơ chế đọc sửa của các DNA polymerase I và III (Proofreading repair) là cơ chế quan trọng nhất, tiến hành việc cắt bỏ những bazơ sai không bổ sung, rồi thay thế bằng bazơ đúng bổ sung trong quá trình tái bản DNA. Hoạt tính đọc và sửa chữa lại việc nhận nhầm một bazơ không đối xứng (hình 5 - 8).

Hình 5 - 8. Hoạt tính đọc sửa (proofreading) của DNA polymerase III

- Enzyme hoạt quang (Photoreactivating enzyme) là enzyme exonuclease như CPP photolyase dưới tác dụng của ánh sáng bước sóng 300 nm sễ cắt bỏ thymine dimer, gây lên bởi tia UV ra khỏi phân tử DNA (hình 5 - 9).

- Sửa chữa bằng tái tổ hợp (Recombination repair) là cơ chế sửa chữa sau tái bản DNA chứa Thymine dimmer do tia UV gây ra, bằng cách tái tổ hợp, trao đổi chéo chính xác giữa đoạn có sai sót với đoạn không sai sót giữa 2 phân tử DNA có sai sót trong quá trình phân bào giảm nhiễm tạo giao tử (hình 5 – 10).

- Cơ chế cắt bỏ và chỉnh sửa đúng (cut and patch repair) là cơ chế sửa chữa DNA hỏng, bằng cách dùng enzyme cắt bỏ đoạn sợi đơn có chứa bazơ ghép sai, rồi sau đó tổng hợp sợi đơn mới sử dụng sợi nguyên bản làm khuôn, các bazơ đúng được nhập vào và kết gắn với nhau bằng enzyme DNA polymerase. Kết thúc nhờ enzyme DNA ligase gắn 2 đầu của đoạn mới được chỉnh sửa lại để tạo thành sợi DNA hoàn chỉnh.

Hình 5 - 9. (trái): Cơ chế sửa sai bằng cắt cắt bỏ liên kết chéo giữa 2 thymine liền kề nhờ hoạt tính enzyme quang hoá.

Hình 5 - 9. (phải): Sơ đồ sửa sai bằng cơ chế cắt bỏ 2 thymine liền kề của DNA lỗi, trong tối có ánh sáng xanh.

- Sửa cắt chỉnh bazơ sai cơ chế này liên quan đến 4 bước:

+ Nhận biết bazơ sai.

+ Lắp nhập phức protein sửa sai vào vị trí.

+ Cắt đi vài nu đầu trên và dưới đoạn có bazơ sai, tách bỏ đoạn cắt (khoảng 30 bazơ) giữa 2 điểm cắt.

+ Sử dụng sợi đơn không chứa bazơ sai làm nguyên bản để DNA polymerase tổng hợp lại.

- Sửa chữa việc ghép nhầm bazơ bổ sung sau tái bản (mismatch repair), gồm 3 bước:

+ Nhận biết những cặp bazơ có ghép nhầm.

+ Xác định bazơ nào bị nhầm.

+ Cắt bỏ bazơ nhầm và tiến hành chỉnh sửa tổng hợp lại.

- Sửa lại chiều hướng dẫn đến sai sót (Error-prone repair) = SOS repair là cơ chế sửa chữa DNA sai hỏng ở E.coli khi enzyme DNA pol.III đang tổng hợp DNA. Đầu tiên ánh sáng UV kích thích sản sinh ra một enzyme gọi là RecA protease. Khi DNA pol.III tiến đến vị trí có bazơ sai trên sợi nguyên bản, đoạn DNA nguyên bản trước đó không mở xoắn nữa. protease này bám chặt lấy một protein khác là SSBP hình thành lên sợi DNA protein RecA. Sợi RecA này có hoạt tính sinh học làm tín hiệu kích thích một số gen mã hoá tạo một số thành viên DNA polymerase, những enzym này có thể vượt qua được khối cản tái bản, tiếp tục tái bản và đóng góp vào cơ chế nhằm chống lại những sai hỏng trong sợi DNA.

- Sửa lại những nơi gẫy cả 2 mạch DNA (repair of double-strand breaks hay nonhomologous end joining, NHEJ). Khi DNA bị chiếu tia X hoặc tia ion thường làm gẫy cả 2 mạch đơn của sợi DNA kép, là nguyên nhân gây lên đột biến mất đoạn DNA dẫn đến làm tế bào chết. Quá trình nối 2 mạch đơn lại được biết là do 2 protein có mặt nhiều trong tế bào tên là KU70 và KU80 đảm nhiệm. Hai protein này bọc lấy nơi gẫy hình thành lên heterodimer có 2 chức năng: hạn chế sự gẫy hỏng thêm và kết nạp thêm một số protein khác giúp tạo ra đầu 5 P và 3 OH để enzyme ligase IV nối 2 đầu lại.

Có rất nhiều cơ chế sửa sai nhưng nhìn chung các cơ chế trên đều thực hiện theo thứ tự đầu tiên là việc nhận biết vị trí bắt cặp không phù hợp, hoặc phát hiện mạch mới tổng hợp sai và cắt ngay tại vị trí sai sau đó sửa lại đúng.

5.2.3. Các cơ chế sửa sai DNA nằm ngoài quá trình tái bản

DNA tĩnh cũng có thể bị gắn thêm 1 phân tử bất kỳ lên các bazơ, hoặc bị tạo thêm cầu nối bên trong mạch và giữa 2 mạch, cầu nối DNA-protein, hay sự hoạt loại bỏ các bazơ. Cơ chế sửa chữa những trường hợp này như sau:

- Sửa chữa trực tiếp bằng: Trong trường hợp có sự hình thành các dimer giữa 2 thymine do tác động của tia tử ngoại UV, các enzyme photolyase có khả năng loại bỏ chúng thông qua hiện tượng quang hóa.

- Trường hợp các bazơ guanine bị methyl hóa thì enzyme 6-0-methyl guanine transferase sẽ loại bỏ các nhóm methyl này. Đây là phương thức sửa sai trực tiếp bằng các enzyme đặc trưng cho từng biến đổi.

- Sửa sai gián tiếp là quá trình sửa sai thông qua 2 giai đoạn (hình 5 - 11).

+ Giai đoạn đầu: Bazơ sai hỏng được nhận biết và được loại trừ bởi các enzyme glycosylase, sau đó các enzyme AP endonuclease cắt sợi đơn DNA ngay tại vị trí đã bị mất bazơ hỏng, hoặc một cơ chế khác được tiến hành bởi phức hợp các protein UVR gồm UVRA, UVRB, UVRC, các phức hợp này nhận biết nơi sai hỏng rồi gắn vào vị trí đó và cắt bỏ một đoạn khoảng 12 nucleotide (hình 5 - 12).

+ Giai đoạn tiếp theo nhằm tái tổ hợp lại các bazơ thích hợp tại vị trí đó kết quả là tạo ra phân tử DNA trở lại trạng thái bình thường như trước khi bị biến đổi.

Hình 5 - 11. Cơ chế sửa bazơ sai bằng cách cắt bỏ và kết gắn bởi lần lượt các enzyme glycosylase, AP endonuclease và ligase.

Ở vi khuẩn, phần lớn các gen tham gia vào quá trình sửa sai đều thuộc hệ thống bảo vệ phức tạp như hệ thống SOS. Sản phẩm protein của các gen này như protein RecB, C, E, F, J và K tham gia vào cả 2 quá trình là sửa sai và tái tổ hợp DNA.

Hình 5.12. Cơ chế sửa sai nhờ phức hợp Uvr.

A) UvrC và B nhận biết vị trí có nu hỏng và gắn vào đó;

B) Cắt bỏ đoạn hỏng bằng enzyme helicase II;

C) Tổng hợp và nối đoạn trống nhờ enzyme Pol I và ligase.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Trình bày quá trình tái bản bán bảo toàn DNA ở sinh vật prokaryote. Các thành phần tham gia vào quá trình tái bản DNA.

2. Nêu sơ đồ quá trình tái bản DNA theo Okazaki. Tại sao hướng tổng hợp DNA trên hai sợi đơn nguyên bản lại phải khác nhau.

3. Nêu quá trình hoàn chỉnh sợi đơn mới DNA. Đoạn Okazaki là gì, chiều dài có thay đổi không.

4. Quá trình tái bản DNA ở sinh vật Eukaryote, sự khác và giống nhau với sinh vật Prokaryote.

5. Nêu sơ đồ kết thúc tổng hợp DNA ở đầu telomere của nhiễm sắc. Cơ chế bảo vệ telomere của sinh vật xảy ra như thế nào.

6. Telomerase là gì, hoạt động của telomerase có liên quan đến bệnh già trước tuổi và bệnh ung thư không tại sao.

7. Nêu các cơ chế sửa sai xẩy ra trong quá trình tái bản DNA, cơ chế đọc sửa, và hoạt quang.

8. Nêu các cơ chế sửa sai nằm ngoài quá trình tái bản DNA.

Chương 6 CÁC CƠ CHẾ GÂY BIẾN ĐỔI DNA

Cũng như mọi quá trình sinh học khác, tái bản DNA xảy ra cũng có những sai lệch. Mặc dù sinh vật có cơ chế chỉnh sửa lại nhưng vẫn không sửa chữa hết được và đột biến DNA sẽ xảy ra. Điều này là cần thiết giúp cho giới sinh vật them đa dạng, thích ứng và tiến hóa như hiện nay. Trong chương này chúng ta sẽ đề cập đến các cơ chế phân tử của đột biến gen và các nguyên nhân gây lên sự biến đổi trong phân tử DNA của 2 sinh vật: tiền nhân và nhân chuẩn.

6.1. ĐỘT BIẾN

6.1.1. Đặc điểm của đột biến

- Đột biến là những thay đổi đột ngột có khả năng di truyền trong vật chất di truyền (DNA), đột biến bao gồm cả 2 nội dung là những thay đổi trong vật chất di truyền và quá trình làm thay đổi nó.

- Một cơ thể sinh vật có biểu hiện kiểu hình khác thường do kết quả của đột biến gọi là thể đột biến (mutant).

- Thay đổi kiểu gen bao gồm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể, cấu trúc nhiễm sắc thể, nhóm gen liên kết và nhỏ nhất là thay đổi trong một gen. Chúng ta sẽ đề cập đến đột biến gen, nhiều đột biến do thay đổi một cặp bazơ, thay cặp này bằng cặp khác, lặp lại, tăng hoặc mất chỉ một vài nucleotide (đột biến điểm).

- Đột biến là nguyên nhân chính tạo ra tất cả các biến dị di truyền, làm cơ sở cho tiến hóa.

- Nếu không có đột biến thì tất cả các gen chỉ tồn tại ở một dạng, sẽ không có tồn tại nhiều alen, bởi vậy việc phân tích di truyền sẽ không thể tiến hành được và một điều vô cùng quan trọng là sinh vật sẽ không thể tiến hóa, không thể thích ứng được với sự thay đổi của môi trường.

- Đột biến tự nhiên (spontaneous mutation) là đột biến xảy ra không rõ nguyên nhân, do sai sót trong tái bản DNA. Đột biến nhân tạo (induced mutation) xảy ra do cơ thể sinh vật được tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến do con người xử lý như: tia phóng xạ ion, tia tử ngoại, những hóa chất phản ứng tương tác với DNA và RNA.

- Tần số sai sót nhận thấy từ các nucleotide khi tái bản dự đoán khoảng 10-5, một chu kỳ đọc sửa sai (proofreading) nhờ hoạt tính exonuclease 3’-5’ của DNA polymerase sẽ giảm tần số sai sót xuống còn 10-10 (10-5x10-5). Thêm một số cơ chế khác có thể làm giảm tỷ lệ sai sót xuống hơn nữa.

- Tần số đột biến ở vi khuẩn trong tự nhiên từ 10-8 - 10-10 nucleotide/một thế hệ, còn ở sinh vật nhân thật là từ 10-7 – 10-9 nucleotide/một thế hệ.

- Đột biến xảy ra ngẫu nhiên không định hướng theo môi trường (tác nhân gây đột biến), mặc dầu chúng ta quan sát nhiều quẩn thể sinh vật ngày một trở lên chống lại thuốc trừ sâu như loại ruồi nhà chống lại DDT, vi sinh vật chống lại kháng sinh nếu dùng liên tục. Điều đó không phải do môi trường định hướng đột biến mà trong quần thể ngẫu nhiên đã có xuất hiện đột biến chống chịu, đột biến này sẽ tồn tại, sinh sôi nảy nở và tạo thành quần thể thế hệ sau. Việc chọn lọc chủng vi khuẩn kháng kháng sinh streptomicine từ quần thể vi khuẩn được xử lý streptomicine là một ví dụ minh chứng cho điều đó. Cách làm như sau: pha loãng từng tế bào nuôi trong Streptomicine, số ít tế bào có đột biến kháng sẽ sống còn phần lớn sẽ chết.

- Biểu hiện của đột biến thể hiện từ rất nhỏ đến biến đổi cả hình thái hoặc làm sinh vật chết.

- Gen là một đoạn DNA mã hóa một chuỗi polypeptide, bất kỳ đột biến nào xảy ra trong nội bộ gen sẽ tạo thành dạng mới hoặc alen mới của gen rồi có thể tạo ra protein mới. Những gen chứa những đột biến nhỏ muốn phát hiện phải dùng kỹ thuật đặc biệt gọi là (isoallele).

- Đột biến có thể trội hoặc lặn, ở cơ thể đơn bội như virus, vi khuẩn thì cả 2 dạng trội và lặn đều được biểu hiện ra kiểu hình, còn ở cơ thể nhị bội đột biến trội hoặc lặn chỉ được phát hiện ra qua phân tích quần thể đời sau hoặc chuyển được chúng về trạng thái đồng hợp tử, hầu hết đột biến lặn ở nhị bội không thể biểu hiện trừ một số đột biến nằm trên nhiễm sắc thể giới tính.

- Dạng đột biến dễ phân tích nhất là đột biến gây chết có điều kiện, chúng chết trong môi trường này nhưng tồn tại trong môi trường khác. Có 3 dạng đột biến này là:

+ Đột biến dinh dưỡng thụ động là đột biến xảy ra ở vi sinh vật làm cho nó chỉ sống được trong môi trường tối thiểu.

+ Đột biến mẫn cảm nhiệt độ là đột biến chỉ biểu hiện trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, có sản phẩm gen nhưng không bền ở ngoài ngưỡng nhiệt độ trên. Cũng có thể đột biến ở điều kiện nhiệt độ này thì bình thường nhưng ở điều kiện khác thì biểu hiện đột biến.

+ Đột biến mẫn cảm ức chế là đột biến bù lại cho những đột biến khác dẫn đến trở thành bình thường hoặc gần bình thường khi cùng có thêm một đột biến nữa.

- Hầu hết các đột biến biểu hiện hiệu quả kiểu hình là do kết quả của hoạt tính sản phẩm gen bị giảm đi hoặc do không có hoạt tính sản phẩm của gen. Điều này do hiệu quả chọn lọc lâu đời tính thích ứng tối ưu của dạng dại (allele dại).

- Đột biến có thể xảy ra ở bất kỳ tế bào hoặc trạng thái nào trong chu kỳ tế bào, nếu xảy ra ở tế bào soma, tế bào này không sinh giao tử thì chỉ có ở mô đó, và có thể được truyền qua sinh sản vô tính như ví dụ đối với giống táo Delicious và giống cam Navel. Nếu đột biến trội xảy ra trong tế bào phôi thì hiệu quả của đột biến có thể được biểu hiện ngay ở con cháu, tuy nhiên nếu là đột biến lặn thì vẫn không biểu hiện ra.

- Đột biến hemoglobin: hemoglobin là một đại phân tử có mặt trong hồng cầu có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phổi đến tất cả các mô khác nhau của cơ thể. Có 2 kiểu hemoglobin ở người là dạng F khi trong trạng thái trẻ sơ sinh (new born) và dạng A khi người đã trưởng thành. Hemoglobin A gồm 2 chuỗi ( giống nhau và 2 chuỗi (, còn dạng F gồm 2 chuỗi ( và 2 chuỗi ( . Mỗi chuỗi được mã hóa bởi một gen đặc trưng. Chuỗi ( chứa 141 amino acid, chuỗi ( và ( chứa 146 amino acid, các chuỗi này khá giống nhau về trình tự chuỗi amino acid, cho nên người ta cho rằng chúng đều xuất phát từ một gen chung. Có nhiều biến dạng hemoglobin được phát hiện chủ yếu là từ Hemoglobin A. Một trong chúng là đột biến tế bào hồng cầu lưỡi liềm là Hemoglobin S (alen S, Hbs(/HBs() là một dạng biến đổi của chuỗi (. Phân tử này kết tủa khi bị thiếu oxy, hình thành lên thể ác tính làm biến đổi hình thái tế bào hồng cầu tạo thành hình lưỡi liềm (hình 6 - 1).

Hình 6 - 1. Đột biến hồng cầu thành hình lưỡi liềm

6.1.2. Cơ sở phân tử của đột biến

Khi Watson và Crick đề xuất mô hình chuỗi xoắn kép DNA, đã giả thiết cơ chế tái bản DNA bán bảo toàn trên cơ sở ghép cặp đặc thù bazơ để giải thích quá trình truyền đạt trung thành thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Hai ông còn đề xuất một cơ chế giải thích đột biến tự nhiên và cấu trúc bazơ nitơ không bất biến. Nguyên tử hydro có thể rời từ ví trí NH2 hoặc chuyển đến ví trí 0 của một purine hoặc pyrimidine để tạo thành bazơ hiếm, thí dụ nguyên tử H từ nhóm amin trở thành NH hoặc H đến kết hợp với O thành OH trong vòng nitơ, quá trình này gọi là (tautomeric –shift) sự trôi dạt nguyên tử H (hình 6 - 2).

- Thí dụ Thymine và Guanine dạng bình thường là dạng keto khi chuyển thành trạng thái hiếm enol, chúng có thể lần lượt được kết hợp với dạng keto của Guanine và Thymine bằng 3 liên kết hydro.

Có 3 dạng đột biến điểm:

- Tương tự adenine và cytosine bình thường ở dạng amino khi trở thành dạng hiếm imino chúng có thể lần lượt kết hợp với dạng amino của cytosine và adenine bằng 2 liên kết hydro (hình 6 - 3). Điều này trái với bình thường là T=A, G(C. Các trạng thái tautomeric thường tồn tại một thời gian ngắn, tuy nhiên nếu xuất hiện vào lúc tái bản, thì quá trình nhận nhầm và đột biến dễ xảy ra. Kết quả có thể tạo ra sự thay thế một bazơ purine hoặc pyrimidine dạng này bằng bazơ purine hoặc pyrimidine khác (đây gọi là quá trình transition, quá trình chuyển tiếp hay quá trình quá độ (hoán vị).

Hình 6 - 2. Trạng thái tautomeric chuyển từ trạng thái bình thường keto, amino thành dạng hiếm enol và imino của 4 bazơ nitơ

- Quá trình thay thế cặp bazơ liên quan đến việc thay thế một purine bằng một pyrimidine khác và ngược lại gọi là quá trình chuyển qua (transversion).

- Thêm hoặc bớt một vài cặp bazơ ở khung đọc mở gọi là đột biến thay đổi khung đọc mở (frame shift mutation) (hình 6 - 4).

Hình 6 - 3. Hiện tượng ghép cặp đôi nhầm của các bazơ hiếm có thể sẽ dẫn đến ghép bất bình thường A = C và G ( T.

Hình 6 - 4. Sơ đồ do đột biến thêm 1 cặp bazơ làm thay đổi khung đọc mã và tạo

Hình 6-4. Đột biến thêm một cặp bazơ sinh ra chuỗi protein bị biến đổi

- Có thể tóm tắt một số khả năng biến đổi làm thay thế các nu trong phân tử DNA tái bản trình bầy ở hình 6 - 5.

Hình 6 - 5. Sơ đồ các khả năng biến đổi bazơ xẩy ra, mũi tên đường liền là giữa bazơ Pu –Pu và giữa Py-Py, đường đứt giữa Pu - Py và ngược lại

6.1.3. Hậu quả của đột biến DNA

- Hậu quả của đột biến tuỳ thuộc vào nơi xẩy ra đột biến và kiểu đột biến xẩy ra.

- Đột biến điểm xẩy ra ở đoạn DNA phiên mã sẽ:

+ Làm biến đổi thành codon khác nhưng mã hoá cùng một amino acid so với trước gọi là đột biến câm (Synonymous or silent mutation).

+ Biến đổi thành codon khác rồi mã hoá một amino acid khác (missense mutation).

+ Biến đổi codon từ mã hoá cho một amino acid thành một codon dừng dịch mã sẽ tạo ra protein ngắn lại (nonsense mutation).

- Đột biến xẩy ra ở đoạn không phiên mã gồm các vùng mà enzyme RNA polymerase và những protein khác bọc lấy mới cho phép quá trình phiên mã tiến hành sẽ ảnh hưởng đến cường độ phiên mã, lượng mRNA và protein sinh ra. Dưới góc độ RNA thì các vùng bị ảnh hưởng bao gồm:

+ vị trí bọc của ribosome đối với mRNA vi khuẩn.

+ vị trí cắt 5’ và 3’ để kết nối các exon của mRNA sinh vật nhân chuan.

+ những vị trí điều hoà quá trình dịch mã và định vị mRNA trong tế bào.

Các dạng đột biến này rất khó phát hiện so với những đột biến xẩy ra ở vùng mã hoá và ảnh hưởng không nhiều đến biểu hiện kiểu hình sinh vật.

6.1.4. Ung thư là hậu quả của đột biến

U ác tính hay u ung thư là tập hợp các tế bào được sinh ra từ một tế bào gốc bất bình thường. Tế bào ung thư khác so với tế bào bình thường bởi nhiều đặc tính như: tốc độ phân chia nhanh hơn, xâm lấn lãnh địa của những tế bào mới khác, có tốc độ trao đổi chất cao hơn và có hình dạng bất thường. Nguyên nhân là do một số yếu tố điều khiển sự phát triển của tế bào bình thường trong tế bào ung thư bị biến đổi. Rất nhiều loại tế bào có khả năng trở thành tế bào ung thư. Một số được truyền từ cha mẹ qua dòng tế bào phôi, nhưng hầu hết là do đột biến tế bào soma gây lên.

Có nhiều tác nhân gây ra tế bào ung thư và có 2 loại đột biến gây ung thư là đột biến những gen trực tiếp sinh ra ung thư và đột biến những gen ức chế đặc tính gây ung thư. Loại đầu có 2 đặc điểm là thường gen đột biến ung thư sinh ra protein ung thư trong tế bào khối u và chỉ cần một alen đột biến cũng gây lên khối u. Còn đột biến gen mất chức năng ức chế ung thư là đột biến lặn, tạo ra protein làm mất một phần hoặc mất hết khả năng ức chế ung thư. Đồng thời để phát triển thành ung thư thì cần phải có cả 2 alen của locus gen cùng bị đột biến.

Loại đột biến tiền ung thư (proto-oncogene) chia ra làm 2 loại: loại một chỉ gây ung thư nếu sản phẩm protein của nó được hoạt hoá khi có mặt của một tín hiệu điều hoà phù hợp như chất nhận yếu tố sinh trưởng, protein truyền tín hiệu và chất điều hoà phiên mã. Loại 2 sản phẩm gen đột biến hoạt động ức chế khả năng phá huỷ những tế bào bị sai hỏng, kết quả là gây ra tế bào ung thư.

Bình thường có một số gen có chức năng điều khiển chu kỳ phân chia tế bào một cách bình thường, những gen này nếu bị đột biến dẫn đến tế bào phân chia bất thường và gây ra ung thư.

6.1.5. Tác nhân lí hóa gây đột biến

a. Tác nhân vật lý

(1) Tia phóng xạ, tia X quang, tia (, tia vũ trụ, tia cực tím, phóng xạ ion như X quang, có bước sóng 0,1 - 1nm, có năng lượng cao dùng trong chẩn đoán y học vì chúng có khả năng xuyên qua mô. Trong quá trình xuyên, chúng va đập vào các nguyên tử, giải phóng ra electron tạo ra các ion tích điện dương, những ion này đập vào phân tử khác lại giải phóng ra electron (điện tử).

(2) Tia cực tím (UV) có năng lượng thấp được hấp thụ bởi các bazơ purine và pyrimidine biến nó thành dạng hoạt hóa và kích động. Vì năng lượng của tia này thấp nên khả năng đâm xuyên vào mô chậm chạp thường chỉ xuyên được vào lớp bề mặt tế bào của sinh vật đa bào, nên nó thướng có tác dụng gây đột biến đối với sinh vật đơn bào. DNA hấp phụ tối đa tia UV ở bước sóng 254 nm và tại bước sóng này gây tần số đột biến cao. Cơ chế hấp phụ UV và gây tạo chất dễ hoạt hóa (hình 6-6), khi cytosine + UV + H2O sẽ tạo thành cytosine hydrate, khi có 2 thymine nằm gần cạnh nhau + UV sẽ tạo thành thymine C5= C5 . Thymine (thymine dimer), dạng này sẽ gây lên quá trình ghép nhầm hoặc làm chấm dứt quá trình tái bản.

Hình 6 - 6. Tác động của tia UV làm biến đổi bazơ pyrimidine thành dạng hiếm

b. Tác nhân hóa học chia làm 5 nhóm

Hơi độc hoặc hơi sulfur (mustard gas hoặc sulfur mustard) (bảng 6 - 1), có tác dụng alkyl hoá bazơ

Bazơ tương đồng như: 5 BU (5 Bromouracil) và 2AP (2 aminopurine), tác dụng làm tăng tần số ghép cặp nhầm, 5 BU là bazơ tương đồng với thymine, còn Br ở vị trí C5 tương tự như nhóm –CH3 ở C5 trong thymine. Sự có mặt Br làm thay đổi phân bố điện tích, làm tăng khả năng chuyển vị nguyên tử hydro. Ở trạng thái keto bền, 5 BU ghép cặp với Adenine, sau khi có chuyển vị hydro thành dạng enol thì 5BU lại ghép cặp với Guanine (hình 6 - 3). Hiệu quả gây đột biến của 5BU tương tự như quá trình tautomeric shift (hình 6 - 7).

Bảng 6 - 1. Hơi độc có tác dụng gây biến đổi các bazơ của DNA

Hình 6 - 7. Cơ chế tạo đột biến điểm do hiện tượng trôi dạt tautomeric tạo bazơ hiếm gây quá trình ghép cặp đôi nhầm.

Nếu 5BU tồn tại ở trạng thái hiếm enol như một nucleotide 3 phosphate tại thời điểm nó gắn nhập vào mạch DNA, nó sẽ gắn vào guanine mạch gốc và gây ra hiện tượng transition (hoán vị) từ GC( AT (hình 6 - 8).

Hình 6 - 8. Sơ đồ tác động của dạng enol 5BU kèm theo quá trình tái bản DNA gây nên đột biến

Nếu 5BU kết gắn với Adenine dạng keto, sau khi tautomeric shift sẽ biến thành dạng enol, quá trình sao chép sau đó sẽ tạo ra hoán vị từ A-T thành GC (hình 6 - 8b). Do vậy 5BU gây ra quá trình hoán vị theo 2 hướng AT( GC, nên có thể tạo ra cả 2 hướng đột biến trên.

3. HNO2 tác động vào DNA trong cả lúc tái bản và không tái bản, bằng cách oxy hóa khử gốc amin của các bazơ, A, G, và C (hình 6 - 9). Thí dụ làm adenine biến thành hypoxanthine, chất này sẽ ghép cặp với cytosine hơn là với thymine, còn cytosine đảo thành uracine sẽ ghép cặp với adenine thay vì bình thường ghép với guanine. Quá trình khử amin của Guanine sẽ biến thành xanthine, chất này ghép cặp với cytosine giống như Guanine. Do vậy khử amin của Guanine không tạo được đột biến giống như đối với adenine và cytosine. HNO2 gây đột biến hoán vị theo 2 hướng AT(GC.

4. Thuốc nhuộm acridine là proflavin và hàng loạt các hợp chất có tên gọi là ICR-170, ICR-191 là những chất có tác dụng gây đột biến rất mạnh, có thể tạo ra các đột biến thêm mất cặp bazơ. ICR có chứa phần acridine gồm những chuỗi có kích thước khác nhau, các chất này thường là tác nhân alkyl hóa. Acridine tích điện dương tự xen vào giữa cặp bazơ xếp chồng nhau (hình 6-10), làm tăng độ cứng chắc và thay đổi tính ổn định của chuỗi xoắn kép, tạo ra những thắt nút nhẹ trong phân tử DNA. Khi phân tử DNA có chứa acridine xen vào mà tái bản sẽ xẩy ra tăng thêm hoặc mất đi cặp bazơ kết quả sẽ tạo ra đột biến.

Hình 6 - 9. Cơ chế gây đột biến do

tác động của HNO2:

a) biến đổi adenine thành hypoxanthine

làm cặp AT biến thành GC;

b) biến đổi cytosine thành uracine làm cặp GC biến thành AT;

c) biến đổi guanine thành xanthine dẫn đến làm AT biến thành GC và ngược lại.

Hình 6 - 10. Quá trình chèn xen của acridine proflavin vào chuỗi xoắn kép DNA tại đó cặp bazơ có thể được tăng thêm hoặc mất đi dẫn đến đột biến.

5. Tác nhân alkyl hóa và hydroxyl hóa như: MMS, EMS (methyl và ethyl methane sulfonate, nitroguanidine (NTG), chúng có tác dụng gây đột biến mạnh bằng cách chuyển gốc methyl và ethyl vào bazơ làm quá trình ghép cặp bình thường bị đảo lộn dẫn đến đột biến thay thế bazơ của purine hoặc pyrimidine bằng bazơ khác cùng nhóm. Thí dụ: Ethyl hóa tại vị trí 7N vào 6-O do chất EMS tạo thành 7 ethyl guanine sẽ ghép cặp với thymine (hình 6 - 11 và hình 6 - 12).

Hình 6 - 11. Giả thuyết gây đột biến do EMS

(a) làm Guanine ghép nhầm với Thymine;

(b) do NH2OH làm Adenine ghép nhầm với Cytosine

Sản phẩm alkyl hóa các bazơ khác có tác dụng hoạt hóa quá trình sửa chữa giống như tạo thành 2 thymine. Những sai sót hiếm hoi này xảy ra trong quá trình sửa chữa sẽ tạo thành đột biến kiểu transverion và frameshift (hình 6-12). Một số hợp chất có 2 nhóm alkyl hoạt hóa gây bắt chéo (cross-link) sợi đơn DNA hoặc phân tử DNA làm nhiễm sắc thể bị gẫy, tạo ra đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. Alkyl hóa ít gây đột biến đặc thù như chất tương đồng và HNO2 hoặc acridine. Nó có thể tạo ra tất cả các kiểu đột biến với tần xuất rất khác nhau, phụ thuộc vào hóa chất và nồng độ.

6. Nitrosoguanidine (NTG) gây lên hàng loạt các đột biến liên kết gần nhau trong một đoạn nhiễm sắc thể đang tái bản trong khi bị xử lý, nên ít được sử dụng trong nghiên cứu di truyền.

7. Hydroxylamine NH2OH, ngược với nhóm alkyl có tác dụng gây đột biến đặc thù, tuy nhiên cơ chế chính xác vẫn chưa rõ, nó hydroxyl hóa nhóm amin của cytosine (hình 6 – 11b) tạo thành hydroxylaminocytosine, chất này ghép cặp với adenine tạo thành đột biến hóan vị GC( AT.

8. Những đột biến do HNO2​ và bazơ tương đồng gây lên đột biến kiểu transition, có thể chia ra làm 2 loại: loại một là những thể có cặp AT ở tại nơi bị đột biến, sẽ không bị đột biến đảo ngược bởi hydroxylamine, loại thứ 2 có cặp GC tại điểm đột biến sẽ bị đảo ngược bởi hydroxylamine. Bởi vậy hydroxylamine được dùng để xác định tính đặc thù của đột biến xảy ra từ AT( GC hoặc GC( AT hoán vị.

Hình 6 - 12. Cơ chế tác động gây đột biến của một số tác nhân alkyl hoá.

a) Tác động của EMS (ethyl methanesulfonate) biến guanine thành 7-ethylguanine sẽ ghép cặp bất thường với thymine;

b) Tác động của NH2OH (hydroxylamine) biến cytosine thành hydroxylaminocytosine sẽ ghép nhầm với adenine.

6.2. CÁC NGUYÊN NHÂN GÂY BIẾN ĐỔI DNA Ở VI SINH VẬT

6.2.1. Tái tổ hợp ở E.coli tạo biến đổi DNA

Thông tin di truyền của vi khuẩn được tàng trữ chủ yếu trong một nhiễm sắc thể chính, trung bình dài khoảng 5 Mb, chứa vài nghìn gen và có thể có hoặc không cã thể di truyền ngoài nhiễm sắc gọi là episome hoặc plasmid. Plasmid biến động theo kích thước dài từ 1 – 200 kb, có từ 3 gen đến hàng trăm gen. Có tế bào vi khuẩn chứa đến 11 loại plasmid khác nhau. Episome là nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể của vi khuẩn như thực khuẩn thể lamda (phage lambda) hoặc yếu tố giới tính F. Episome có thể tái bản độc lập với nhiễm sắc thể ký chủ hoặc là một đơn vị thành phần gắn vào nhiễm sắc thể ký chủ. Nhiễm sắc thể của vi khuẩn khác với nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn ở chỗ nó chỉ gồm các nucleoid. Nucleoid là vùng chứa DNA, thường chứa hơn 2 bản nhiễm sắc thể vi khuẩn giống hệt nhau.

Tái tổ hợp DNA ở vi khuẩn là cơ sở di truyền phân tử hình thành nên các chủng vi sinh vật mới. Quá trình tái tổ hợp xảy ra theo 3 cách thức là biến nạp, chuyển nạp và tiếp hợp.

a. Biến nạp ở vi khuẩn (transformation)

Là quá trình những gen, dưới dạng một đoạn DNA hòa tan, được chuyển từ dòng tế bào vi khuẩn này sang dòng tế bào vi khuẩn khác, các đoạn DNA này có thể từ tế bào sống hoặc đã chết. Các đoạn DNA này được hòa tan trong môi trường ngoài có thể thâm nhập vào tế bào chỉ khi tế bào vi khuẩn nhận có vùng tiếp nhận trên bề mặt màng (competent cell). Khi vào bên trong, các đoạn này thường thay thế bằng cách tái tổ hợp với vùng DNA ngắn tương đồng của tế bào chủ. Quá trình biến nạp được chia thành các bước (hình 6 – 13) như sau:

+ Gắn sợi DNA kép nạp vào bề mặt vị trí nhận tế bào tiếp nhận.

+ Hấp thụ DNA cho, lúc này DNA cho có khả năng chống lại DNase.

+ Biến đổi sợi DNA kép cho, thành sợi đơn DNA nhờ enzyme phân rã exonuclease.

+ Gắn cộng hóa trị vào toàn bộ hoặc một phần sợi đơn DNA cho vào thay thế đoạn tương ứng trong nhiễm sắc thể nhận, tạo sợi DNA lai có 2 sợi đơn cơ bản có trình tự tương đồng nhau trừ trình tự tại gen a/a+, ở chỗ này gọi là DNA dị hợp kép (heteroduplex) là trạng thái trung gian quan trọng trong quá trình đột biến, tái tổ hợp và sửa chữa DNA, chúng phân ly trong quá trình tái bản. Phân ly và biểu hiện kiểu hình của những gen cho gắn vào hoặc những gen tái tổ hợp. Ở các thế hệ tế bào sau sẽ tạo ra một số biến đổi DNA hoặc thể biến nạp.

Hình 6 - 13. Sơ đồ biểu diễn hai bước chính hấp thụ và kết gắn đoạn gen ngoại trong quá trình chuyển nạp gen ở vi khuẩn Pneumococus.

a) Hấp thụ DNA trên bề mặt màng tại đây nhờ enzyme exonuclease liên kết màng hoặc DNA translocase kéo một sợi đơn DNA ngoại vào trong tế bào sử dụng năng lượng tạo ra nhờ quá trình phân rã sợi đơn DNA còn lại. Đoạn DNA ngoại mang chỉ thị di truyền a+; Nhiễm sắc thể tế bào chủ chỉ chứa một đoạn DNA mang chỉ thị alen a.

b) Sợi đơn DNA ngoại gắn xen vào nhiễm sắc thể và đẩy một sợi đơn DNA của nhiễm sắc chủ ra ngoài. Sợi đơn ngoại ghép cặp bazơ bổ sung với hầu hết các bazơ của đoạn sợi đơn chủ tiếp nhận trừ vị trí a. Sự ghép lỗi xảy ra tại vị trí a+/a tại đây sợi đơn DNA ngoại mang alen a+ còn sợi đơn DNA của chủ mang alen a. Lúc này phân tử DNA được gọi là phân tử dị hợp kép, làm trung gian trong quá trình đột biến tái tổ hợp và sửa chữa DNA. Khi tái bản lần sau sẽ phân ly tạo nên thể vi khuẩn biến nạp.

b. Chuyển nạp (transduction)

Là quá trình chuyển vật chất di truyền từ một vi khuẩn này sang một vi khuẩn khác thông qua phage vector. Trong trường hợp chuyển nạp có giới hạn hay chuyên tính thì chỉ có một số gen của vi khuẩn là được chuyển nạp vì phage có một vị trí đặc hiệu có khả năng xâm nhập được vào nhiễm sắc thể của tế bào ký chủ và chỉ những gen của vi khuẩn nằm ở gần vùng đó sẽ được chuyển nạp. Bacteriophage lambda là vector chuyển nạp chuyên tính mang gen gal và bio của vi khuẩn. Do vậy vector loại này luôn chứa 2 phần, một phần của thùc khuÈn thÓ và một phần là của vi khuẩn ký chủ E.coli.

- Chuyển nạp rộng (generalized transduction)

Trường hợp chuyển nạp rộng thì thực khuẩn thể có thể gắn vào hầu hết và bất cứ nơi nào trên nhiễm sắc thể ký chủ, do đó mà hầu hết các gen của tế bào ký chủ đều có thể được chuyển nạp cùng với virus sang tế bào vi khuẩn khác. Các thùc khuÈn thÓ chuyển nạp thường thiếu một hoặc một số chức năng của phage bình thường nên có thể không tái bản được trong tế bào ký chủ mới trừ khi có sự trợ giúp của một thực khuẩn thể trợ giúp (phage helper) bình thường khác. Trường hợp chuyển nạp rộng, thì thực khuẩn thể được chia thành 2 loại dựa trên cơ sở phản ứng của chúng với tế bào vi khuẩn. Thực khuẩn thể gây nhiễm (virulent phage) thường xuyên nhân lên và phân rã tế bào sau lây nhiễm. Thực khuẩn thể ôn hòa (temperate phage) tồn tại giữa 2 trạng thái sống sau lây nhiễm (hình 6 - 14).

Hình 6 - 14. Hai hướng gây nhiễm của thực khuẩn thể ôn hoà E.coli phage (.

Quá trình gây nhiễm của thực khuẩn thể vào tế bào vi khuẩn có thể xẩy ra như sau:

- Cách thứ nhất phân rã (lytic pathway): Sau khi chui được vào tế bào vi khuẩn chúng tiến hành sinh sản và phân rã tế bào ký chủ giống như trường hợp của thực khuẩn thể gây nhiễm.

- Cách thứ 2 gen xen (lysogenic pathway): Sau khi xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, nhiễm sắc thể của thực khuẩn thể kết gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn ký chủ và tái bản giống như bất kỳ những đoạn DNA nào khác của nhiễm sắc thể ký chủ.

Chuyển nạp rộng được thông qua bởi một số thực khuẩn thể độc tính và thực khuẩn thể ôn hòa nào đó mà nhiễm sắc thể của nó không kết gắn vào tại những vùng đặc thù trên nhiễm sắc thể ký chủ. Không phải tất cả các thực khuẩn thể gây nhiễm đều có thể làm trung gian cho quá trình chuyển nạp. Ví dụ: Các thực khuẩn thể T (T2, T4, T6) phân giải DNA chủ và sử dụng lại các nucleotide đơn này để tổng hợp lên DNA của thực khuẩn thể, cho nên DNA của ký chủ không tồn tại để lắp ghép khôi phục lại ở thế hệ sau. Loại thực khuẩn thể khác có thể không phân giải được DNA của ký chủ,vì nhiễm sắc thể của ký chủ quá lớn cho quá trình lắp ghép toàn bộ, chúng sẽ không có thể hình thành lên những thể chuyển nạp.

Sau khi thực khuẩn thể chuyển đẩy (tiêm) đoạn DNA vào tế bào nhận, đoạn DNA đó có thể kết gắn vào nhiễm sắc thể tế bào nhận tương tự như quá trình biến nạp chỉ khác là đoạn DNA gắn vào đó là sợi kép, hoặc tồn tại tự do ở trong tế bào chất và khi đó đoạn đó không tái bản được nên chỉ truyền cho một thế hệ tế bào. Khi đó các gen nằm trong đoạn được chuyển nạp có thể biểu hiện. Tế bào mang đoạn này được gọi là những thể chuyển nạp không thành (thui) lúc này chúng có một số phần là nhị bội có thể được sử dụng để tiến hành thử nghiệm đối xứng đề nghiên cứu những đột biến khác nhau có thể xảy ra trên một gen hay nhiều gen khác nhau.

- Chuyển nạp đặc thù vị trí (specilized transduction)

Thông qua thực khuẩn ôn hòa mà nhiễm sắc thể của nó có khả năng gắn tại một hoặc một vài vị trí đính đặc thù trên nhiễm sắc thể ký chủ. Nhiễm sắc thể của phage ôn hòa thuộc kiểu này có cả 2 khả năng:

+ Tự tái bản độc lập cùng với nhiễm sắc thể của tế bào ký chủ.

+ Tái bản đoạn được kết gắn vào nhiễm sắc thể tế bào ký chủ và tái bản cùng với nhiễm sắc thể ký chủ.

Hình 6 - 15. Sơ đồ quá trình kết gắn và cắt của nhiễm sắc thể thực khuẩn thể lambda. Khi nhiễm sắc thể lambda bắt đầu xâm nhiễm, thì nó là một phân tử DNA mạch thẳng chứa trình tự các gen từ A đến R.

Do vậy người ta gọi những thực khuẩn thể thuộc kiểu này là episome hoặc yếu tố F trong vi khuẩn, khi đó tế bào vi khuẩn có chức năng này gọi là vi khuẩn có giới tính đực (cho). F là một phân tử DNA vòng có chứa khoảng 94.000 cặp bazơ, bằng khoảng 2,5% tổng lượng DNA của nhiễm sắc thể ký chủ E.coli, khoảng 1/3 số gen trong F liên quan đến việc chuyển vật liệu di truyền đực sang cho cái, là tế bào vi khuẩn không có yếu tố F.

Sau khi lây nhiễm chúng chuyển thành sợi vòng. Khi lamda đi theo hướng ôn hoà chúng tiến hành trao đổi và kết gắn DNA của mình vào DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ tại vị trí đặc thù giữa pp’ trên nhiễm sắc thể của phage và vị trí kết gắn lambda bb’ của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Quá trình kết gắn nhờ sản phẩm của gen int biến vi khuẩn trở thành trạng thái prophage và trình tự của gen lambda sẽ là p’-CIII R-A-J-p.

- Cơ chế kết gắn tái tổ hợp DNA của thực khuẩn thể vào DNA nhiễm sắc thể E.coli tạo thành nhiễm sắc thể vi khuẩn tái tổ hợp prophage (hình 6 - 15). Trong prophage, những gen có liên quan đến quá trình tái bản của virus, làm tan rã tế bào vi khuẩn thì sẽ bị ức chế hoặc ngừng hoạt động. Vi khuẩn nào mang prophage được gọi là vi khuẩn lysogenic. Vi khuẩn lysogenic sẽ miễn dịch với quá trình xâm nhiễm lần sau của cùng một virus.

- Khi thực khuẩn thể ôn hòa trải qua trạng thái phân chia tế bào hiếm với tần suất khoảng 1/105 thì từ trạng thái prophage có thể chuyển sang trạng thái thực khuẩn thể độc lập và nhiễm sắc thể ký chủ riêng biệt (trạng thái lytic state). Quá trình trên có thể được kích thích bởi tia UV, như vậy thực khuẩn thể phải cắt ra khỏi nhiễm sắc thể tế bào ký chủ nhưng theo những vị trí đặc thù, thường là chính xác. Đôi khi quá trình cắt xảy ra không phải ở chỗ gắn ban đầu mà ở một nơi khác sẽ xảy ra trường hợp một phần DNA của thực khuẩn thể còn lại trên nhiễm sắc thể vi khuẩn, ngược lại một phần DNA của vi khuẩn lại bị cắt ra và mang theo thực khuẩn thể (hình 6 - 16).

Hình 6 - 16. Sơ đồ biểu diễn quá trình hình thành thể chuyển nạp đặc thù chứa gen (dg.

Quá trình xảy ra giống như hình 6 - 15 trừ trường hợp tái tổ hợp không xảy ra tại vị trí tương đồng giữa bp’ và pb’ thay vào đó tái tổ hợp xảy ra giữa một vị trí trong vùng gen gal của nhiễm sắc thể ký chủ và một vị trí ở trong vùng chứa từ gen F đến gen J trên nhiễm sắc thể lambda. Kết quả nhiễm sắc thể lambda được ngắt ra sẽ gồm một đoạn DNA chủ chứa vùng gen gal và phần gen J của lambda nằm lại ở nhiễm sắc thể ký chủ.

- Chỉ những gen nằm gần vị trí thực khuẩn thể kết gắn mới có thể bị cắt ra cùng với thực khuẩn thể, một đoạn ngắn ở cả 2 phía. Ví dụ thực khuẩn thể ( gắn vào vùng giữa gen gal cần cho việc sử dụng đường lactose làm năng lượng và gen bio cần cho việc tổng hợp biotin của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Lambda như thế thường chỉ chuyển nạp chỉ thị gal và bio. Còn thực khuẩn thể chuyển nạp chuyên tính (80 thì lại kết gắn vào vùng gần những gen trp của vi khuẩn (cần để tổng hợp a.amin triptophan) thì lại chuyển nạp chỉ thị trp.

Hình 6 - 17. a) Sơ đồ mô tả quá trình kết gắn nhiễm sắc thể ( dg mang gen gal+ vào nhiễm sắc thể ký chủ mang gen gal- để hình thành nên thể biến nạp nhị bội gal+/gal-.

b) Nhờ sự kết gắn nhiễm sắc thể (+ trợ giúp để hình thành nên nhiễm sắc thể ký chủ lai chứa thể vi khuẩn (+/(dg kép.

Thể vi khuẩn này dưới tác động của tia UV sẽ tạo ra một Hfr chứa 50% gen của (dg và 50% của (+. Nếu như tế bào chủ lúc này được nhiễm với đơn thể (dg sẽ thu được tỷ lệ tế bào nhiễm phage thấp, còn nếu như tế bào ký chủ được lây nhiễm cả hai (dg và (+ sẽ thu được tỷ lệ tế bào nhiễm phage cao và tất cả các tế bào nhiễm đều mang cả hai phage (dg và (+. Nếu tỷ lệ phage/ vi khuẩn đủ lớn thì vi khuẩn nhận cũng bị nhiễm cả ( kiểu dại, genome của ( dại sẽ gắn xen vào vị trí đính của ( bình thường tạo ra thể chuyển nạp mang một (+ prophage và một (dg (hình 6.8b). Lúc này thể chuyển nạp sẽ trở thành thể lưỡng bội từng phần gal+/gal- gọi là thể dị hợp (gal+/gal- heterogenote) và chứa gal+ (exogenote, đoạn DNA cho) và gal- (endogenote, nhiễm sắc thể nhận). Thể lưỡng bội từng phần gal+/gal- này thường kém bền vững, chúng phân li thành những tế bào gal- với tần số khoảng 1/1000 tế bào phân chia do bị cắt bỏ nhiễm sắc thể (dg. Vì (dg không thể tái bản khi không có mặt của phage trợ giúp, vì thế ( dg thường bị đào thải. Tái tổ hợp có thể xảy ra giữa gal+ exogenote và gal- endogenote nhằm chuyển gal+ cho gal- endogenote để tạo thành thể chuyển nạp gal+ bền vững. Vì sự có mặt của những gen ( kiểm tra khả năng miễn dịch của những nhiễm sắc thể vi khuẩn chứa (dg cho nên thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần sẽ miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của ( này. Nếu thể chuyển nạp chứa (dg và (+ kép, bị kích hoạt bởi tia uv chúng sẽ sinh ra 50% thể chứa (dg và 50% thể chứa (+; cả hai prophage này sẽ bị cắt rời và sẽ tái bản sử dụng sản phẩm gen mã hoá bởi genome (+. Những tế bào này gọi là tế bào Hft. Tế bào Hft có thể tạo thành từ dị hợp gal+/gal-(heterogenote) bằng cách nhiễm chúng với ( kiểu dại từ sau đó kích hoạt bằng tia uv.

Hợp phần nhiễm sắc thể chuyển nạp được tạo ra bằng hình thức chuyển nạp chuyên tính khác nhiều so với hợp phần nhiễm sắc thể chuyển nạp được tạo ra do hình thức chuyển nạp rộng hoặc biến nạp. Ở trường hợp sau, tái tổ hợp hình thành do sự thay thế đoạn nhiễm sắc thể vi khuẩn nhận bằng đoạn nhiễm sắc thể của vi khuẩn cho. Đối với trường hợp chuyển nạp chuyên tính thì đoạn DNA của vi khuẩn cho và nhiễm sắc thể của thực khuẩn thể cùng nhập vào nhau và gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhận (hình 6 - 17a) tạo ra thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần (gal+/gal-). Thể chuyển nạp lưỡng bội từng phần có một số hệ quả quan trọng. Thực khuẩn thể chuyển nạp được tạo ra gọi là ( dg ( ( thiếu gal), vì ( này không còn chứa gen gal cần thiết cho sinh trưởng và trưởng thành, thay vào đó là đoạn DNA của vi khuẩn. ( dg chỉ được sinh ra khi có mặt của thực khuẩn thể ( trợ giúp (( phage helper) dạng dại. Chữ g chứng tỏ rằng có tồn tại những gen của vi khuẩn đó là gen gal chứ không phải là gen bio. Những ( chứa gen gal khi bị kích thích bởi tia UV sẽ sinh ra một số ít ( dg, là thưc khuẩn có chứa gen gal từ vi khuẩn cho. Khi ( dg xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn nhận không chứa gen gal, thì ( dg sẽ nhập vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhận bằng cách trao đổi chéo trong nội vùng gen gal tại vị trí ( đính vào. Bởi thế vi khuẩn không có gen gal không có khả năng sử dụng đường galactose.

c. Tiếp hợp (conjugation)

Phát hiện đầu tiên bởi J. Lederberg (1946) và E.L.Tatum (1958) cả 2 cùng được nhận chung giải thưởng Nobel sinh học. Trong quá trình tiếp hợp DNA sẽ được chuyển từ tế bào cho (male) sang tế bào nhận (female) (hình 6 - 18). Khi 2 tế bào tiếp xúc với nhau ống tiếp hợp giữa chúng hình thành, xẩy ra hình thức chuyển DNA một chiều. Tế bào nào có khả năng cho khi tiếp hợp sẽ bị phân hóa do sự có mặt yếu tố F pili (yếu tố giới tính). Yếu tố F là vi khuẩn đực, F là một phân tử vòng giống plasmid dài khoảng 94.000 bp = 2,5% tổng DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn E.coli và chứa 1/3 số gen của vi khuẩn. Yếu tố F có chứa gen liên quan đến việc chuyển vật chất di truyền từ vi khuẩn đực sang vi khuẩn cái và tạo cả ra ống nối giúp cho DNA truyền qua.

Hình 6 - 18. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quá trình hình thành ống tiếp hợp và

nhận nhân tố giới tính F+ của tế bào F- từ tế bào Hfr.

F factor có thể tồn tại ở 2 trạng thái khác nhau: Trạng thái độc lập (autonomous) khi đó chúng tái bản độc lập với nhiễm sắc thể ký chủ và trạng thái kết gắn vào nhiễm sắc thể ký chủ, trở thành một bộ phận của nhiễm sắc thể tế bào ký chủ và cùng tái bản với tế bào ký chủ (hình 6 - 19).

Hình 6.19. Ba trạng thái khác nhau của tế bào E.coli.

I, không chứa yếu tố F; II, Tế bào F+ chứa yếu tố F độc lập; III, tế bào Hft chứa yếu tố F kết gắn vào nhiễm sắc thể ký chủ.

Tiếp hợp xẩy ra giữa F+ với F- thì chỉ có yếu tố F được truyền sang F- còn tiếp hợp giữa Hfr với F- thì xẩy ra quá trình cắt dời F khỏi nhiễm sắc thể rồi mới chuyển sang F-.

Hình 6 - 20. Quá trình chuyển từ tế bào F+ thành tế bào Hfr thông qua kết gắn yếu tố F tự do vào nhiễm sắc thể ký chủ theo cơ chế cắt đảo ngược như yếu tố IS, thứ tự gen a, b, c và d trên yếu tố F khi nhập vào nhiễm sắ thể vi khuẩn sẽ thay đổi đọc như chiều mũi tên.

Tế bào nào chứa yếu tố F độc lập gọi là tế bào F+. Khi tế bào F+ tiếp xúc với tế bào vi khuẩn không chứa F+ là tế bào vi khuẩn nhận gọi là tế bào F- thì chỉ nhân tố F được truyền từ tế bào F+ sang tế bào F- và tế bào này trở thành tế bào F+. Bởi vậy nếu trộn lẫn hai tế bào này với nhau thì thế hệ sau sẽ cho ra hầu hết các tế bào đều là F+. Yếu tố F có thể kết gắn vào một trong nhiều vị trí bằng cơ chế trao đổi tương đồng (hình 6 - 20). Việc kết gắn của yếu tố F vào nhiễm sắc thể của tế bào ký chủ do những đoạn DNA ngắn gọi là những nhân tố IS. Tế bào vi khuẩn chứa nhân tố F kết gắn vào gọi là tế bào Hfr (high frequency recombination). Ở trạng thái kết gắn Hfr, yếu tố F có thể làm vật trung gian cho việc chuyển một phần nhiễm sắc thể của tế bào Hfr sang cho tế bào nhận F-, thường thì chỉ một phần của nhiễm sắc thể Hfr được chuyển sang. Cơ chế chuyển DNA từ tế bào cho sang tế bào nhận trong quá trình tiếp hợp bắt đầu bằng việc cắt một mạch ở một điểm đặc thù của yếu tố F. Đầu 5’ của sợi đơn bị cắt sau đó được chuyển qua ống tiếp hợp rồi vào tế bào nhận (hình 6 - 21). Vì điểm bắt đầu chuyển nằm trong phạm vi của yếu tố F nên lần lượt các phần của F được chuyển từ tế bào Hfr cho tế bào F-, khi chuyển sẽ theo lần lượt các gen nằm trên nhiễm sắc thể Hfr. Phần còn lại của F cuối cùng cũng có thể được chuyển theo.

Hình 6 - 21. Cơ chế truyền DNA trong quá trình tiếp hợp.

a) Tế bào cho chứa F+ hoặc Hfr.

b) Khi tiếp hợp với F- enzyme endonuclease cắt sợi đơn DNA của yếu tố F tại điểm duy nhất.

c) Đầu 5’ của sợi bị cắt trên yếu tố F của tế bào cho sẽ được tái bản để bù lại theo cơ chế vòng lăn, còn sợi đơn vừa được cắt ra sẽ chuyển sang tế bào F- qua ống tiếp hợp, và tổng hợp thành sợi kép theo từng đoạn Okazaki, sau đó gắn lại bằng ligase thành thể tế bào F+ mới.

d) Quá trình chuyển nạp theo một chiều từ Hfr hay F+ sang F- có thể bị ngắt quãng, do ống tiếp hợp có thể bị gẫy nên ít khi toàn bộ bộ gen được chuyển sang. Tùy kích thước genome của E.coli có chứa F+ mà thời gian chuyển toàn bộ sang F – có thể mất tới 90 phút. Bằng cách ngắt quãng quá trình tiếp hợp vào thời điểm nhất định (5, 10, 15, 20, …) bằng phương pháp rung lắc mạnh. Mẫu vi khuẩn được pha loãng ở mỗi thời điểm để tách dòng, dùng các gen chỉ thị giữa 2 chủng vi khuẩn chúng ta có thể xác định được thứ thứ tự của các gen tính từ điểm cắt đầu 5. Khoảng cách giữa các gen có thể tính theo 3 loại đơn vị là thời gian chuyển được qua, đơn vị tái tổ hợp và đơn vị cặp bazơ. Ví dụ nếu một phút tiếp hợp tương đương với 20 đơn vị tái tổ hợp ở E. coli và chuyển toàn bộ một nhiễm sắc thể vòng của nó sang vi khuẩn nhận mất 100 phút, thì tổng chiều dài của vi khuẩn là 2000 đơn vị tái tổ hợp. Nếu tổng chiều dài DNA genome vi khuẩn dài 107 bp thì một đơn vị tái tổ hợp sẽ dài 107/2000 bằng 5000 bp.

e) Bằng cách này chúng ta có thể giải thích được cơ chế hình thành nên rất nhiều chủng vi khuẩn mới có các tổ hợp gen khác nhau. Và đây cũng là một trong những cơ chế di truyền hình thành nên rất nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh và hũu ích mới.

6.2.2. Mô hình tái tổ hợp theo Holliday (Holliday model)

Là mô hình mô tả hàng loạt các sự kiện đứt nối xảy ra trong quá trình trao đổi chéo giữa 2 nhiễm sắc thể tương đồng ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao.

a. Để hiểu cơ chế này chúng ta cần nắm một số vấn đề sau:

- Trao đổi chéo xẩy ra giữa 2 cặp nhiễm sắc thể tương đồng trong quá trình giảm phân.

Hình 6 - 22. Sơ đồ trao đổi chéo giữa 2 locus gen A, a và B, b. Trao đổi chéo chỉ xẩy ra

trên 2 trong 4 nhiễm sắc thể chi em hình thành nên giao tử tái tổ hợp.

Hình 6 - 23. Trao đổi chéo xẩy ra ở nấm Neurospora giữa 2 locus gen A,a và B,b.

a) Trao đổi chéo xảy ra trước khi nhân đôi nhiễm sắc thể qua phân bào giảm nhiễm sẽ tạo ra 100% giao tử tái tổ hợp.

b) Trao đổi chéo xảy ra sau tái bản DNA, giai đoạn tứ tử thể sẽ thu được 50% giao tử tái tổ hợp giữa 2 gen.

- Vị trí của một gen trên nhiễm sắc thể gọi là locus, chúng được xắp xếp thành chuỗi đường thẳng.

- 2 alen của một gen trong cơ thể dị hợp tử chiếm vị trí tương ứng trên 2 nhiễm sắc thể tương đồng, alen A nằm trên nhiễm sắc thể tương đồng một còn allele kia (a) nằm trên nhiễm sắc thể tương đồng 2.

- Trao đổi chéo liên quan đến việc gãy một trong 2 nhiễm sắc thể tương đồng (thực tế là nhiễm sắc thể tử) rồi trao đổi các phần cho nhau.

- Trao đổi chéo xảy ra ở giai đoạn sợi thô (pachytene) giai đoạn 2 nhiễm sắc thể tương đồng (tetrad) hoàn toàn tiếp hợp với nhau, mỗi bộ gồm 2 nhiễm sắc tử kép hay cặp lưỡng trị. Trao đổi chéo xảy ra giữa các nhiễm sắc tử có thể xảy ra giữa 2 nhiễm sắc tử của một nhiễm sắc thể tương đồng nhưng không phát hiện được vì chức năng của cả 2 đều giống nhau.

- Trao đổi chéo tạo thành nhiễm sắc thể có tổ hợp mới các gen liên kết gọi là trao đổi chéo ở vùng giữa 2 locus gen.

- Tần số trao đổi chéo giữa 2 locus tăng dần theo khoảng cách giữa 2 gen.

b. Cơ chế trao đổi chéo đơn theo Holliday

- 2 phân tử DNA kép của 2 nhiễm sắc tử không chị em xếp thẳng hàng cân xứng với nhau, để khi trao đổi không làm mất đi hoặc nhân lên bất kỳ một thông tin di truyền nào (a).

- 2 sợi đơn của cùng một đối cực bị khía đứt ở vị trí tương ứng nhờ enzyme endonulease, làm gẫy ra (b).

- Mỗi chuỗi gẫy rời khỏi mạch cũ nhờ enzyme bọc DNA (DNA binding) hoặc protein tháo xoắn DNA (DNA unwinding protein) và ghép cặp với mạch đơn không gãy ở chuỗi kép đối diện nhờ protein RecA (c).

- Enzyme ligase gắn liền những sợi gãy lại để tạo thành điểm nhánh trong (d và c), nhánh này tự do quay vặn sang phải hoặc trái (f), do đó nó có thể thay đổi vị trí chuyển động được gọi là hiện tượng dịch chuyển nhánh (branch migration). Thí dụ: nhánh chéo được rời sang phải lúc này phân tử DNA được vẽ có 2 vai bị kéo đứt chuyển đến hình (g), đoạn ab bị quay 1800 so với đoạn AB, kết quả tạo lên hình X, ở hình này chúng ta có thể thấy rõ 4 phần (sector) sợi DNA đơn của vùng nhánh.

- Để tách cấu trúc này thành 2 sợi kép thì quá trình cắt sợi đơn do enzyme endonuclease tại vùng nhánh chéo xảy ra. Chiều cắt có thể xảy ra theo hướng thẳng đứng sẽ tạo ra hình (h) hoặc cắt ngang sẽ trở lại như ban đầu. Ở chiều cắt thẳng đứng sợi kép được tách ra có dạng như hình (i), sau đó vết khía sẽ được kết dính lại nhờ enzyme DNA ligase thì sợi kép mỗi một mạch sẽ chứa một mảnh như hình (j).

Trong trường hợp nhiễm sắc tử trao đổi chéo đơn (Ab và aB) người ta đã phát hiện thấy những cấu trúc tương tự của phân tử vẽ ở hình (g) được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có tên là Holliday intermediate (1964) hay cấu trúc khi (().

Quá trình tái tổ hợp xảy ra được cần có 2 điều kiện:

+ 2 vùng DNA tái tổ hợp phải có trình tự tương đồng.

+ Và một trong 2 trình tự đó phải có điểm đứt trên một mạch.

Điều khiển quá trình tái tổ hợp do các protein RecB và RecC, là sản phẩm của gen RecB và RecC của hệ thống SOS, có tác dụng tháo xoắn và cắt đứt một trong 2 mạch DNA. Sự cắt đứt này do phức hợp RecBC nhận một trình tự gọi là trình tự ( và cắt cách đó vài bazơ, sau đó protein RecA gắn lên mạch DNA bị đứt sẽ tạo thuận lợi cho việc nhận biết trình tự tương đồng ở mạch kia và hình thành lên phân tử lai và cắt sửa lại nhờ enzyme exonulease và DNA polymerase.

©m men cã thÓ tån t¹i æn ®Þnh á������������������������������������������������������������������������������������������������

Hình 6 - 24. Sơ đồ các đường hướng gãy nối lại các sợi nhiễm sắc thể tương đồng với sự tham gia của một số enzyme theo Holliday, 1964 và bổ xung bởi H. Potter và D. Dressler, 1976.

c. Trao đổi chéo kép

Là mô hình gãy mạch kép tái tổ hợp. (a) nhiễm sắc tử tương đồng một chứa 2 gen A & B dưới tác động của enzyme endonuclease và exonuclease sẽ tạo thành lỗ hổng (gap)(b), tiếp tục do xúc tác bởi 2 enzyme này làm sợi DNA của nhiễm sắc tử tương đồng một bị gẫy rời (c). Đầu mạch đơn tự do ở chỗ cắt bị xen gắn bởi phân tử DNA của nhiễm sắc thể tương đồng 2 (d), quá trình này được xúc tác bởi protein kiểu RecA, tạo thành 2 bắt chéo. Sau đó 2 bắt chéo bị đứt và được lấp đầy bởi các enzyme polymerase và ligase. Quá trình kết gắn sẽ làm 2 sợi kép dính vào nhau tại 2 vị trí bắt chéo tạo thành 2 phân tử DNA tái tổ hợp (f).

Hình 6 - 25. Mô hình trao đổi chéo kép giữa 2 gen A, a và B, b.

d. Trao đổi chéo kết hợp với chuyển đổi gen hoặc sửa chữa đoạn gen hỏng (gen conversion).

Khi xảy ra ghép nhầm tại m giữa 2 nhiễm sắc tử trong tứ trị (tetrad), nhờ cơ chế tổng hợp sửa chữa (repair synthesis) chỉnh lại chỗ nhầm, chuyển m thành m+ đồng thời vừa xảy ra trao đổi chéo đơn dẫn đến tạo ra các nhiễm sắc tử có 3m+ và 1m chứ không như bình thường là 2 m+ và 2m (m là dạng đột biến). Nếu số lượng bản sao và các gen hoạt động là tiêu chuẩn chọn lọc, thì gen không hoạt động sẽ bị đào thải sau nhiều lần tái tổ hợp.

Hình 6 - 26. Mô hình trao đổi chéo kép Holliday kết hợp với loại bỏ phần sai hỏng

tạo ra các loại giao tử khác nhau

e. Quá trình tái tổ hợp gen lặp lại

Trong genome có nhiều gen lặp lại, nếu có trao đổi chéo xẩy ra giữa các đoạn gen tương đồng sẽ sinh ra hiện tượng mất, tăng hoặc đảo đoạn dẫn đến đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. Quá trình tái tổ hợp cũng có thể làm tăng hoặc giảm số lượng các bản sao của gen lặp lại. Nếu các gen lặp lại nhiều lần trên một nhiễm sắc thể, thì sự bắt cặp có thể xảy ra ở bất kỳ bản sao nào (vị trí bắt chéo nào) của mỗi nhiễm sắc thể tương đồng.

Tái tổ hợp có thể xẩy ra không đều giữa các cặp nhiễm sắc thể tương đồng dẫn đến tạo ra nhiễm sắc thể này có nhiều bản sao còn nhiễm sắc thể kia thì ít bản sao hơn. Tái tổ hợp còn là cơ sở cho sự điều hòa biểu hiện của gen. Nhiều gen ở điều kiện bình thường thì bất hoạt do thiếu trình tự khởi động, khi tái tổ hợp nếu trình tự khởi động được chuyển đến sẽ trở lên hoạt động.

6.3. CÁC GEN NHẢY HAY YẾU TỐ DI ĐỘNG (transposable element)

Đầu tiên được phát hiện bởi Barbara McClintock thông qua phân tích tính biến động di truyền ở ngô, nhờ vậy mà năm 1983 bà đã nhận giải thưởng Nobel. Yếu tố nhảy là một trình tự DNA có khả năng gắn xen vào hay rời ra khỏi DNA của nhiễm sắc thể, trên trình tự này có chứa các gen dẫn đến làm biến đổi hoạt động di truyền của các gen. Ở E.coli cũng có yếu tố nhẩy là trình tự IS (insert sequence) hay là trình tự gắn xen. Sau đó người ta phát hiện ở cả động vật và thực vật cũng có những yếu tố tương tự nhưng có cấu trúc phức tạp hơn gọi chung là transposon.

6.3.1. Trình tự IS

Phát hiện đầu tiên ở E.coli do tác động ức chế của chúng lên hoạt động của các gen, khi có IS xen vào trong gen tương ứng thì vi khuẩn mất khả năng sinh enzyme galactose, khi yếu tố này dời khỏi gen thì quá trình sinh enzyme galactose lại được tiến hành. IS có chiều dài khoảng 1 kb, loại nhỏ nhất chỉ dài từ 10 - 40 bp gồm một đoạn trung tâm đặc trưng cho từng IS, 2 đầu là 2 đoạn ngắn (khoảng 15 - 25 bp) giống nhau nhưng ngược chiều nhau. Vì các trình tự IS không mã hóa ra protein do vậy chỉ phát hiện được thông qua tác hại của chúng. Hai đầu của IS là nơi nhận biết của enzyme transporase, IS còn chứa gen mã hóa enzyme transporase, xúc tác cho quá trình gắn xen (hình 6 - 27).

Hình 6 - 27. Sơ đồ cấu trúc nhân tố IS50 và 2 bản sao 2 đầu của IS50

tính từ giữa ra gồm 2 bản sao dài 9 bp, giống nhau nhưng ngược chiều nhau (terminal inverted repeats) tiếp đến là 2 đoạn tái bản đích dài 9 bp giống nhau và cùng chiều nhau (target site duplication).

Yếu tố IS 50 khi gắn xen vào nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc thể plasmid sẽ tạo ra 2 bản sao kép (duplication) tại vị trí gắn xen, bản sao này dài từ 3-12 cặp nucleotide, gọi là bản sao vị trí đích, được coi là tác nhân gây nên sự gẫy so le sợi DNA mạch kép (hình 6 - 28). Ở vi khuẩn E.coli, IS hỗ trợ cho việc gắn xen episome vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

Hình 6 - 28. Sơ đồ tạo ví trí tái bản đích do quá trình gắn xen nhân tố IS.

Nhân tố này gây nên sự gẫy cắt tại vị trí DNA đích sau đó gắn xen IS vào, phần sợi đơn trống được lấp đầy lại đã tạo nên 2 đoạn lặp lại 2 bên giống nhau nhưng ngược chiều.

6.3.2. Transposon

Là một dạng trình tự nhảy, phát hiện ở cả sinh vật tiền nhân và sinh vật nhân chuẩn, nó được chặn 2 bên bằng một đoạn lặp lại có chiều ngược nhau, tiếp đến lại được kẹp bởi đoạn lặp lại trực tiếp (hình 6 - 27). Transposon có kích thước lớn hơn IS, bên trong cũng mang các gen mã hóa cho enzyme transporase và resolvase, đây là các enzyme xúc tác cho quá trình tái tổ hợp đặc thù vị trí. Giữa 2 transposon có một trình tự lặp lại trực tiếp có cấu trúc đồng kết gắn (cointergrate structure), đó là quá trình kết gắn giữa 2 phân tử DNA vòng, một trong chúng có chứa transposon vòng, còn DNA kia thì không.

6.3.3. Transposon tổng hợp (composite transposon)

Được tạo thành sau khi 2 IS khác nhau cùng gắn xen vào một vị trí gần nhau. Đoạn DNA giữa chúng sau đó có thể được di chuyển bởi hoạt tính đồng kết gắn của những nhân tố kề bên cạnh. 3 thí dụ về các dạng transposon này được trình bày ở (hình 6 - 29; 6 - 30 và 6 - 31)

Hình 6 - 29. Cấu trúc của các trasposon tổng hợp, chiều và số bp.

a) Cấu tạo Tn9 gồm 2 IS1 dài 768 np kẹp biên gene cam chống lại chloramphenol

b) Tn5 gồm 2 yếu tố IS50 dài 1533 np kẹp biên gene kháng kanamycin.

c) Tn10 gồm 2 yếu tố IS10 kẹp biên gen kháng lại tetracycline.

Hình 6 - 30. Tác dụng điều khiển của Tn5

a) vào quá trình lây nhiễm của thực khuẩn thể mang Tn5 vào vi khuẩn E.coli . Tế bào nào chứa Tn5 sẽ hạn chế quá trình chuyển nạp. Cơ sở di truyền của gen điều khiển Tn5 như sau : b) Yếu tố IS50R tạo ra 2 protein, một protein chính là enzyme transposase, xúc tác cho quá trình chuyển vị còn một protein khác chính là repressor lại ức chế quá trình chuyển vị. Protein ức chế thường nhiều hơn transposase cho nên hiệu quả ức chế của nó thường vượt trội hơn.

Hình 6 - 31. Cấu tạo gen của Tn3 gồm 3 gen, protein chúng tạo ra và chiều dài các gen

6.3.4 Các cơ chế hoán chuyển gen ở vi khuẩn

Trước hết dưới tác động của enzyme transporase, đoạn DNA nơi sẽ nhận đoạn gắn xen sẽ bị cắt đứt ở cả 2 mạch, hình thành lên 2 đầu so le (cohensive end). Sau đó việc hoán vị gen được thực hiện nhờ enzyme resolvase. Enzyme resolvase có vai trò xúc tác cho quá trình tái tổ hợp đặc thù vị trí giữa 2 transposon tồn tại như là những đoạn lặp lại trực tiếp trong cấu trúc đồng kết gắn. Quá trình này có thể xảy ra 2 khả năng:

1/ Transposon được tái bản, bản cũ ở lại vị trí ban đầu, bản sao kia chuyển đến vị trí mới.

2/ Transposon bị cắt rời và chuyển sang vị trí mới như vậy vị trí cũ bị mất transposon (hình 6 - 32)

Plasmid cho chứa một copy Tn3 còn plasmid nhận không chứa Tn3 gặp nhau nhờ enzyme transposase do gen tnpA của Tn3 sinh ra sẽ xúc tác việc hình thành nên đồng kết gắn làm 2 plasmid kết gắn lại với nhau. Trong quá trình xẩy ra Tn3 nhân đôi tạo thành 2 Tn3 ở 2 đầu gắn. Enzyme resolvase do gen tmpR tạo ra, xúc tiến quá trình nội trao đổi chéo, sẽ tạo thành 2 plasmid mới đều cùng chứa Tn3.

Hình 6 - 32. Quá trình hoán chuyển Tn3.

Ví dụ về quá trình chuyển vị của Tn3. Khi plasmid cho, chứa một copy Tn3 còn plasmid nhận không chứa Tn3 được trộn lẫn với nhau. Enzyme transporase được sinh ra nhờ gen tnpA của Tn3 sẽ xúc tác cho quá trình đồng kết gắn giữa 2 plasmid này lại, kết quả sẽ tạo thành một plasmid lai tái tổ hợp, cũng trong quá trình này Tn3 cũng được tái bản nên có thêm một copy nữa ở đầu nối đối diện của plasmid lai. Enzyme resolvase được tạo ra nhờ gen TnpA của Tn3 sẽ xúc tiến quá trình nội tái tổ hợp giữa 2 Tn3. Kết quả quá trình tái tổ hợp này sẽ làm 2 plasmid tách nhau ra và mỗi thể có thêm một Tn3.

6.3.5. Các transposon ở Eukaryote

Nếu transposon ở vi khuẩn có nguồn gốc từ DNA thì phần lớn các transposon của Eukaryote đều bắt nguồn từ RNA. Các RNA được gắn xen vào bộ gen theo cơ chế giống như các retrovirus sử dụng, chính vì thế mà chúng còn được gọi là các retroposon. Thí dụ như cơ chế xâm nhiễm của virus HIV vào cơ thể (hình 6 - 33). Virus HIV (human immunodeficiency virus) là một retrovirus hay retroposon , thuộc nhóm virus sao chép ngược.

Hình 6 - 33. Vòng đời của virus HIV-1.

Bên ngoài thể virus là vỏ glycoprotein (gp) 120, nhờ vậy mà chúng có thể bám được vào bề mặt của tế bào thụ cảm T CD4, tế bào hấp thụ virus, RNA của virus được chuyển thành DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. Sau đó DNA của virus nhập gắn vào DNA của tế bào ký chủ chở thành HIV provirus. Việc điều khiển quá trình phiên mã sinh RNA phụ thuộc vào sản phẩm của gen tat và rev. Giai đoạn đầu, khi chưa có sản phẩm Rev thì chỉ một phần RNA được cắt rời ra của virus HIV, sẽ chuyển ra tế bào chất rồi dịch mã, tạo thành protein Tat, Rev và Nef. Protein Tat quay lại kích thích sự phiên mã để sinh ra RNA dài hơn. Khi lượng protein Rev đạt đến một mức độ nhất định thì toàn bộ chuỗi RNA của virus sẽ rời khỏi nhân, ra tế bào chất để dịch mã sinh ra các protein của virus. Thành phần gồm: các protein cấu trúc, enzyme reverse transcriptase, protein vỏ virus như env, gag và pol… Các protein này lắp ghép lại để bọc lấy RNA của virus để tạo thành một thể virus mới, ra ngoài tế bào rồi đi lây nhiễm sang tế bào khác.

- Tế bào T lymphocyte là tế bào bạch cầu phản ứng miễn dịch khi ghép tạng, có đặc tính chứa chất thụ cảm T. Tế bào phân hóa trong tuyến giáp trạng. Tế bào T thành thục có thể được chia thành 2 nhóm là CD4 và CD8 trên cơ sở khả năng nhận biết nhóm phân tử mô tương hợp nhất định. Tế bào CD4+ nhận nhóm phân tử mô tương hợp loại II có chức năng là tế bào T lymphocyte trợ giúp, còn tế bào CD8+ nhận biết nhóm phân tử mô tương hợp loại I có chức năng khử các chất độc cho tế bào.

- Virus này gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải AIDS (acquaired immune deficiency syndrome), khi xâm nhập vào cơ thể người thường được tế bào bạch huyết T CD4 hỗ trợ hấp thụ và sống ký sinh ở đây, sau này có thể sống trong cả tế bào não.

- Khi bị nhiễm lúc đầu có thể nổi hạch bạch huyết, mệt mỏi, đau mình, sốt lạnh lùng. Số lượng tế bào T CD4 bị giảm nhưng kháng thể vẫn được tiết ra để chống lại virus, vì thế lượng kháng thể có trong máu là một chỉ tiêu dung để chẩn đoán có bị nhiễm HIV hay không. Nhưng kháng thể không có tác dụng tiêu diệt virus vì chúng ký sinh bên trong tế bào hoặc nằm trong nhiễm sắc thể.

- Giai đoạn sau của nhiễm virus HIV có biểu hiện số tế bào T CD4 bị giảm mạnh xuống dưới 250 tế bào/1mm3 (người khỏe có 800 tế bào T CD4), hạch bạch huyết nổi ở cổ, ở nách và ở bẹn rồi bị sưng lên. Đến giai đoạn AIDS (giai đoạn 3) bệnh nhân thường mắc phải các bệnh như lao phổi, viêm phổi hoặc đối với phụ nữ là ung thư dạ con di căn.

- Nguy hiểm của HIV không những phá hủy tế bào miễn dịch T CD4 mà RNA của chúng phiên mã ngược tạo thành DNA và gắn nhập vào DNA của tế bào chủ T CD4.

- Vius HIV chết ở nhiệt độ cao (1350 F trong 10 phút), bởi các hóa chất tẩy rửa, diệt trùng.

- HIV lây qua máu, tinh dịch, tinh âm đạo hoặc sữa mẹ. HIV có thể xâm nhập qua vết rách ở lớp màng nhầy lót cơ quan sinh dục, trực tràng và miệng, tiêm chích ma túy, truyền qua thai nhi, qua máu khi sinh đẻ hoặc qua sữa khi cho con bú.

- Bệnh AIDS hiện rất khó chữa lý do:

+ Kí sinh bên trong tế bào và nằm trong nhiễm sắc thể tế bào T CD4.

+ T CD4 là tế bào đại thực bào, sinh ra để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh khác.

+ Khi bị nhiễm HIV nhiều tế bào T CD4 bị chết, hoặc yếu đi, làm khả năng miễn dịch của cơ thể giảm.

+ Virus HIV có nhiều biến thể, chưa tạo được vaccine đặc hiệu.

+ Truyền qua đường tình dục và truyền máu trong cộng đồng dễ xảy ra.

a. Ở nấm Saccharomyces cerevisiae

Nấm này có 35 copy của một yếu tố nhẩy gọi là TY trong bộ genome đơn bội của mình. Các transposon này dài 5900 cặp nucleotide, bị chặn biên 2 bên bởi một trình tự DNA gọi là trình tự ( dài khoảng 340 bp (hình 6 - 34), cả 2 đều có trình tự theo một chiều như chúng ta đã gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài trực tiếp (long terminal repeats, LTRs).

Hình 6 - 34. Cấu tạo gen yếu tố Ty nấm enzyme và chiều dài gen, trình tự lặp lại 2 đầu ( dài 340 np, mỗi Ty chứa 2 gen là TyA và TyB.

Đôi khi có một LTR từ một TY bị tách ra khỏi TY đó rồi ngắn vào một TY khác tạo lên solo (, quá trình này là kết quả của quá trình tái tổ hợp giữa những LTR của một nhân tố TY hoàn chỉnh (hình 6 - 35). Số phận của phân tử vòng được hình thành qua quá trình tái tổ hợp sau đó như thế nào vẫn chưa rõ, nhưng người ta đã tách được những phân tử này từ tế bào nấm enzyme. Yếu tố TY được chặn biên bởi trình tự lặp lại trực tiếp gồm 5 bp, trình tự này được tạo thành bằng cách nhân đôi DNA tại vị trí TY xen vào. Tái bản tại vị trí đính này không có trình tự cố định, nhưng phần lớn có chứa cặp AT. Điều này chứng tỏ yếu tố TY thường hay xen vào những vùng giàu A-T của genome.

Hình 6 - 35. Quá trình hình thành trình tự solo ( bằng cách cắt yếu tố Ty. Quá trình cắt có liên quan đến tái tổ hợp tương đồng giữa những trình tự solo ( tại các đầu của yếu tố TY.

b. Transposon ở ngô

- Nhân tố Ac và Ds ở ngô

+ Ac là yếu tố chức năng ở nhiễm sắc thể thường chứa 4563 bp chặn 2 bên bằng 2 đoạn lặp lại dài 8 nu (hình 6 - 36). Trình tự trong 8 nu này được hình thành khi Ac được gắn xen vào vị trí của nhiễm sắc thể. Hai đầu của đoạn Ac có 2 đoạn lặp lại ngược chiều nhau dài 11 nu, đoạn này đóng vai trò quan trọng trong quá trình di chuyển. Tất cả các Ac của ngô đều có cấu trúc tương tự nhưng không giống nhau.

+ Khác với Ac, Ds cấu trúc rất khác nhau, có một nhóm Ds sinh ra từ những Ac do mất một trình tự ở giữa . Một nhóm Ds khác lại chứa trình tự lặp lại ở đầu cuối của Ac ngược nhau, cũng như một số trình tự ở gần cuối, nhưng phần DNA còn lại thì khác nhau (hình 6 - 36c). Những thành viên trong gia đình Ac/Ds này được gọi là nhân tố Ds dị thường (aberrant Ds). Nhóm thứ 3 của Ds có đặc điểm sắp xếp cõng đặc thù (pecular piggybacking arrageenzymet) (hình 6 - 36d). Khi một Ds gắn xen vào một Ds khác nhưng theo hướng ngược chiều nhau, thì Ds kép này sẽ có vai trò làm gãy nhiễm sắc thể.

Hình 6 - 36. Nhân tố Ac và Ds ở ngô

(a) Cấu tạo nhân tố Ac; (b) yếu tố Ds không độc lập có nguồn gốc từ Ac bằng cách mất đoạn gags ở giữa,

(c) một Ds dị thường chứa trình tự tận cùng và bán tận cùng có nguồn gốc từ Ac chặn biên đoạn DNA khác không thuộc Ac

(d) yếu tố Dc kép là yếu tố Dc do 2 Dc lồng ghép vào nhau.

- Alu: là những đoạn DNA lặp lại nằm rải rác ở trong genome nhân người, dài khoảng 300 bp, có tất cả 500.000 bản copy này, chiếm tổng chiều dài khoảng 5% lượng DNA của người. Mỗi đoạn được cấu tạo bởi 2 đoạn dài 140 bp DNA, gắn ở 2 đầu là đoạn dài 31 bp. Đoạn này có khả năng di động, khi đó nó bị cắt bởi enzyme giới hạn endonuclease Alu 1.

Mặc dù các transposon và retroposon không đóng vai trò gì trong sinh học, nhưng lại có tác động đến hoạt hóa của gen trong sinh vật mang chúng, nên nó có ý nghĩa trong quá trình tiến hoá của sinh giới.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Đột biến là gì, nêu đặc điểm và vai trò của đột biến DNA trong tiến hóa

2. Nêu cơ sở phân tử của đột biến gen, khi nào đột biến DNA có hậu quả

3. Nêu hậu quả của đột biến DNA. Tại sao nói ung thư là một hậu quả của đột biến DNA .

4. Trình bày tác nhân gây đột biến và cơ chế tác động của chúng.

5. Biến nạp là gì, nêu cơ chế biến nạp DNA vào vi khuẩn.

6. Thực khuẩn thể và vai trò chuyển nạp gen ở vi khuẩn, chuyển nạp rộng và hẹp khác nhau như thế nào nêu ý nghĩa của 2 hình thức chuyển nạp.

7. Tiếp hợp ở vi khuẩn và yếu tố giới tính F. Nêu cơ chế chuyển DNA yếu tố F, từ tế bào F+ sang F‑. Tế bào Hfr là gì, khi nào nó chuyển thành vi khuẩn đực.

8. Nêu vắn tắt mô hình tái tổ hợp DNA ở sinh vật eukaryote gây biến đổi DNA.

9. Gen nhảy hay yếu tố di động là gì, cấu trúc và vai trò của các yếu tố nhảy.

10 Nêu đặc điểm và cấu trúc yếu tố di động TY nấm men, Ds và Ac cây ngô.

11. Cơ chế xâm nhiễm Virus HIV vào cơ thể người như thế nào. Tại sao bệnh AIDS khó chữa.

Chương 7 PHIÊN MÃ, SINH TỔNG HỢP RNA

Gen là đơn vị di truyền, chiếm một vị trí nhất định, một locus trên nhiễm sắc thể và thường dài khoảng vài nghìn bp. Làm thế nào gen quy định được tính trạng? Muốn thế gen phải được phiên mã thành mRNA, từ đó dịch mã tạo thành protein đóng vai trò điều hòa mọi quá trình hình thành lên tính trạng. Trong chương này chúng ta sẽ nghiên cứu quá trình phiên mã từ DNA thành mRNA thành thục, sẵn sàng cho quá trình tổng hợp protein.

7.1. SỐ LƯỢNG GEN CỦA SINH VẬT

7.1.1. Số lượng gen

Hiện nay nhờ thành tựu của công nghệ xác định trình tự DNA toàn genome, chúng ta có thể xác định được số lượng gen của một số sinh vật từ đơn giản đến phức tạp như : vi khuẩn E. Coli có 3200 gen, nấm men Saccharomyces cerevisiae có 6300 gen, ruồi dấm có 13.600 gen. Tại hội nghị khoa học Quốc tế về genome người năm 2000, các nhà khoa học dự đoán ở người có từ 26.000 đến 150.000 gen, chính xác hơn là 25.947 gen. Năm 2003 chúng ta đã hoàn chỉnh việc giải mã bộ genome người. Tại sao người có tổ chức bộ não phức tạp như vậy mà chỉ có số lượng gen lớn gấp đôi loài giun tròn và tương tự như cỏ cay (Arabidopsis thaliana). Điều này được l‎í giải vào cuối những năm 1970, khi người ta phát hiện thấy gen có cấu trúc khảm, bao gồm những đoạn exon xen kẽ những đoạn intron.

Protein của sinh vật bậc cao được tổng hợp từ một gen chứ không phải là một sợi liên tục gồm nhiều gen như ở vi khuẩn.

mRNA là một tập hợp của nhiều đoạn nhỏ exon được nối lại của một gen, còn những đoạn intron bị cắt bỏ trong quá trình thành thục, nhờ bộ máy sinh học có tên là spliceosome, sau đó các mRNA chín mới ra ngoài tế bào chất để tổng hợp nên protein. Nhờ cơ chế cắt và gắn khác nhau mà một gen có thể tạo ra được nhiều mRNA và nhiều protein, thí dụ ở người có khoảng 25.000 gen nhưng đã phát hiện có hơn 100.000 protein. Trong chương này chúng ta sẽ nghiên cứu quá trình phiên mã gen và thành thục của mRNA ở cả 2 hệ thống sinh vật tiền nhân và nhân chuẩn.

7.1.2. Cách xác định số lượng gen

Muốn xác định một cách tương đối số lượng gen của một sinh vật cần phải biết:

- Trình tự toàn bộ genome gồm vùng mang gen và không mang gen, các trình tự của một gen, trình tự phiên mã, trình tự dịch mã của một gen và của các gen có thể biết.

- Trình tự tương đồng và sự đa dạng về trình tự nucleotide của các gen và amino acid của protein, để quy nạp chúng thuộc cùng một gen hay của các gen khác nhau.

- Từ đó dùng phần mềm máy tính để ước lượng một cách tương đối số lượng gen trung bình của một loài sinh vật.

7.1.3. Đặc điểm quá trình sinh tổng hợp DNA và RNA

- Mối quan hệ giữa quá trình tổng hợp DNA, phiên mã , sinh tổng hợp protein và biểu hiện tính trạng được thể hiện như sau: DNA (gen) ( (phiên mã) RNA ( (dịch mã)( protein ( tính trạng.

- Tổng hợp DNA :

+ Xảy ra trong quá trình phân chia tế bào.

+ Có tính ổn định cao, đảm bảo truyền đạt nguyên vẹn bộ gen.

+ Điều hòa của gen ít bị chi phối.

+ Enzyme DNA polymerase cần mồi và không tự tạo được mồi.

- Tổng hợp RNA :

+ Tổng hợp xẩy ra khi có sự biểu hiện hoạt động và điều hòa hoạt động của gen.

+ Liên quan đến tính đa dạng, biến động trong sự biểu hiện các tính trạng di truyền.

+ Biểu hiện và điều hoà của gen ở mức độ phiên mã và mọi giai đoạn của quá trình phiên mã đều có thể chịu sự biến đổi.

+ Enzyme RNA polymerase, tự tạo được mồi, cần trình tự đặc thù trên DNA là promoter để bọc đặc thù mới tiến hành phiên mã tạo RNA.

- Gen ở sinh vật tiền nhân nằm tự do trong tế bào chất, thông tin di truyền trong RNA vừa được phiên mã sẽ tham gia vào dịch mã tạo ra protein luôn.

- Gen ở sinh vật nhân chuẩn chủ yếu nằm ở trong nhân tế bào, quá trình phiên mã và dịch mã xẩy ra ở 2 nơi khác nhau. Phiên mã xẩy ra ở trong nhân, dịch mã xẩy ra ở tế bào chất.

- Phiên mã khác nhau ở 2 loại sinh vật về vị trí và thời gian xảy ra.

- Đặc điểm chung của cả 2 quá trình tổng hợp là:

+ Đều dựa trên cơ sở ghép cặp bổ sung giữa các bazơ và do 2 enzyme DNA và RNA polymerase đều bắt đầu bằng việc nhận biết một trình tự bazơ trên DNA, bọc lấy rồi sau đó mới tiến hành hoạt động tổng hợp trên đó.

+ Thành phần tham gia là 4 NTP, tổng hợp từng nu một, hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5’ P và 3’ OH,

+ Chiều tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’, bắt đầu từ một điểm và kết thúc ở một điểm.

+ Địa điểm xẩy ra đều ở trong nhân.

+ Đều do enzyme trùng phân thực hiện.

7.2. PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE

7.2.1. Quá trình phiên mã tạo RNA từ khuôn DNA (gen) nhờ enzyme RNA polymerase

- RNA được tổng hợp từ một sợi khuôn DNA theo cơ chế bổ sung A-U và C-G.

- Khi tổng hợp, 2 mạch đơn của DNA phải tách rời nhau, nếu promoter nằm ở bên trái (đầu 5’) thì một mạch đơn nguyên bản từ đầu 3’ ( 5’ của DNA sẽ được dùng làm khuôn (hình 7 - 1), sợi RNA được tổng hợp luôn kéo dài từ đầu 5’ – 3’ .

- Trình tự các nu trên RNA giống hệt với mạch đơn nguyên bản 5’ – 3, chỉ khác thay T bằng U.

- Trong bộ genome, các gen ở các vị trí khác nhau, tùy vị trí của promoter nằm ở đầu 3’ hay 5’ của gen đó mà hướng tổng hợp sẽ khác nhau.

- RNA polymerase phải được gắn vào promoter mới phiên mã để tổng hợp sợi RNA.

- Ở sinh vật tiền nhân người ta đã phát hiện có 2 loại RNA polymerase:

+ Primase tổng hợp đoạn RNA mồi dùng trong quá trình tái bản của DNA.

+ Loại khác tổng hợp cả 3 loại RNA (mRNA, tRNA và rRNA), có khả năng bọc được nhiều promoter của nhiều gen khác nhau.

- Quá trình phiên mã mang tính chính xác cao, nhưng do không có cơ chế sửa sai đi kèm nên độ chính xác có thể kém hơn quá trình tái bản DNA.

- Do RNA không được sao chép lại, trừ trường hợp ở một số RNA của virus, nên nếu bị sai sót thì chỉ có tác động tức thời và không truyền lại cho thế hệ tế bào sau.

Hình 7 - 1. Phiên mã tổng hợp RNA trên cơ sở sợi khuôn DNA kép.

- Vị trí mà enzyme RNA polymerase bọc lấy trên phân tử DNA là một đoạn bắt đầu của một đơn vị phiên mã hay operon gọi là promoter. Tốc độ phiên mã tối đa của một đoạn DNA (gen) nhất định phụ thuộc vào trình tự các bazơ của promoter (hình 7 - 2). Promoter thường nằm ở đầu phía 5’ kể từ vị trí bazơ xuất phát phiên mã, đoạn từ nu thứ -10 → - 35 đây là vùng promoter mà RNA polymerase sẽ bọc lấy. Nếu đột biến một trong các bazơ ở vùng promoter sẽ gây ảnh hưởng khác nhau đến quá trình phiên mã đặc biệt nếu đột biến các bazơ ở 2 hộp vị trí thứ -10 và -35.

Hình 7 - 2. Trình tự DNA đặc thù ở vùng promoter đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả phiên mã của enzyme RNA polymerase.

Trình tự 2 hộp -35 và -10 trước điểm bắt đầu phiên mã này rất ổn định ở tất cả các promoter của E.coli. Các trường hợp đột biến thay thế hoặc mất một vài nu ở vùng này sẽ ảnh hưởng khác nhau đến tốc độ của quá trình phiên mã.

7.2.2. Chỉ 1 trong 2 mạch đơn của DNA được dùng làm khuôn để tổng hợp RNA

- 2 mạch đơn của DNA đều có thể được dùng làm khuôn để phiên mã, khi đó sẽ sinh ra 2 mRNA khác nhau, khi dịch mã sẽ cho ra 2 polypeptide khác nhau.

- Quyết định mạch nào làm khuôn là do enzyme RNA polymerase quyết định, do vị trí gắn và hướng di chuyển từ bên phải hay bên trái đoạn DNA (gen) của enzyme quyết định (hình 7 - 3).

- Hướng tổng hợp RNA luôn luôn từ đầu 5’-3’ tương ứng trên sợi đơn nguyên bản từ 3’-5’làm khuôn, do vậy vị trí của promoter nằm ở phía bên nào của gen sẽ quyết định sợi nào sẽ làm nguyên bản và kết quả tạo ra mRNA nào.

Hình 7 - 3. Vị trí gắn của enzyme RNA polymerase.

- Tuỳ từng gen (alen), trội hay đồng trội mà một hoặc có thể cả 2 nhiễm sắc thể đều được dùng làm khuôn, có một số trường hợp gen phiên mã chỉ xảy ra ở một nhiễm sắc thể, hoặc có thể xảy ra ở nhiều gen lặp lại. Vậy vấn đề là khi đó liệu có xảy ra hiện tượng khuếch đại gen hay triệt tiêu lẫn nhau hay không, và trong trường hợp nào sẽ xẩy ra thì cần phải được làm sáng tỏ cụ thể.

7.2.3. Đặc điểm cấu tạo của enzyme RNA polymerase

Ở sinh vật tiền nhân, enzyme RNA polymerase có cấu tạo bậc 4 phức tạp, gồm 5 chuỗi polypeptide. (’, (, (, ( và (, nối với nhau bằng liên kết hóa học yếu. Gen và khối lượng phân tử của từng chuỗi cấu thành enzyme RNA polymerase như sau:

Protein

MW (dalton)

Gen

Omega

11000

?

Alpha

36000

rpoA

Sigma

70000

rpoB

Beta’

151000

rpoC

Beta

155000

rpoB

Vị trí xúc tác trùng phân để tạo ra RNA nằm ở polypeptide beta, polypeptide này còn là nơi chất kháng sinh rifampicin bọc vào. Protein sigma có chức năng nhận biết promoter và khởi động quá trình tổng hợp RNA.

Ở sinh vật nhân chuẩn có 3 loại RNA polymerase trong tất cả các tế bào, mỗi chúng có vai trò nhất định. Mỗi loại RNA (r, t, m) được mã hóa bởi một loại enzyme RNA polymerase. RNA polymerase I (RNA-PI) tồn tại ở trong nucleolus, xúc tác cho việc tổng hơp rRNA. Việc tổng hợp ra các mRNA là do RNA polymerase II (RNA-PII) đảm nhận, có mặt ở trong nucleoplasm, là dịch protoplasm có ở trong nhân của tế bào sinh vật nhân thật. Enzyme này có thêm chức năng gắn đuôi poly. A nhờ enzyme poly (A) polymerase. Còn tRNA và các RNA nhỏ khác nằm trong nhân và tế bào chất được xúc tác bởi enzyme RNA polymerase III. Chứng tỏ có ít nhất 3 loại promoter tương ứng khác nhau cùng tồn tại và điều hoà một cách độc lập 3 loại gen này.

7.3. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE

Chia làm 3 giai đoạn: khởi động, kéo dài và kết thúc.

7.3.1. Giai đoạn mở đầu

Giai đoạn này lại gồm: tiền khởi động, khởi động và rời khỏi promoter của RNA polymerase. Enzyme RNA polymerase, khởi động không cần mồi, nhờ có tiểu đơn vị ( nhận biết được đúng trình tự của promoter để khởi động. Nhiều nghiên cứu gây tạo đột biến mất ( cho thấy RNA polymerase ở thể đột biến này bắt đầu phiên mã từ những vị trí tùy tiện khác nhau so với khi còn ( (dạng không đột biến) thì có khả năng gắn chuyên biệt vào đúng chỗ promoter. Promoter có 2 hộp chứa trình tự mỗi hộp gồm 6 nu, ở cách vị trí bắt đầu tổng hợp RNA 10 cặp bazơ (trình tự -10), còn trình tự kia cách -35 bp (trình tự -35). Hình 7 - 4. trình bầy trình tự cấu trúc 3 loại promoter của 3 operon là Lac, Trp và bio B. Tryptophan synthetase là enzyme xúc tác cho quá trình kết hợp giữa indole với serine để tạo thành tryptophan. Ở E.coli enzyme tổng hợp tryptophan là một phức hợp gồm 4 cấu tử (2 chuỗi ( và 2 chuỗi (). Indole là một hợp chất hoá học của tiền tryptophan.

- Hộp pribnov (Pribnov box) là một đoạn DNA nằm ở phía trước điểm bắt đầu phiên mã của gen cấu trúc sinh vật tiền nhân, ở đó tiểu đơn vị ( của RNA polymerase bọc lấy, gồm 6 nu, thường có trình tự là 5’-TATAAT-3’.

Hình 7.4. Trình tự 3 promoter của Lac, Trp và BioB operon

- RNA polymerase gắn vào promoter theo 2 bước, trước hết nó nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự hộp -35 hình thành một phức hợp "đóng". Sau đó ở trình tự hộp -10 sẽ tháo xoắn dần, tạo ra sợi đơn DNA “mở"  dưới dạng tự do, làm khuôn để sinh tổng hợp RNA. Chính vì thế, promoter là vùng locus ảnh hưởng đến hoạt tính của gen, nên người ta thường gọi promoter là cis-acting loci. Promoter locus không tổng hợp protein nhưng là nơi gắn của những protein bọc DNA tương tự như enhancer và operator.

- Sau khi liên kết phosphodiester đầu tiên của mRNA đầu 5’ được tổng hợp thì RNA polymerase phải rời khỏi promoter và đầu 5’ của mRNA được giải phóng. Khi phiên mã được 23 nu thì RNA polymerase trượt hẳn ra và giai đoạn kéo dài bắt đầu. Quá trình này phụ thuộc vào ATP.

7.3.2. Giai đoạn kéo dài

Khi phân tử RNA bắt đầu kéo dài từ điểm khởi đầu mạch khuôn được 8 nu thì tiểu cấu tử ( của RNA polymerase tách khỏi phức hợp enzyme. Lúc bấy giờ cấu tử ( lại có thể gắn vào một promoter khác để khởi động một quá trình phiên mã mới. Quá trình tách rời ( là cần thiết để mạch RNA tiếp tục kéo dài vì nếu vẫn còn cấu tử ( thì enzyme RNA polymerase không thể tiếp tục kéo dài theo sợi khuôn DNA, thay thế vào vị trí cấu tử ( là các nhân tố kéo dài (EF, elongation factor).

Trong quá trình kéo dài, RNA polymerase tháo xoắn liên tục phân tử DNA khuôn trên theo một chiều dài khoảng 17 nu (kể từ điểm kéo dài cuối cùng) theo tiến triển của quá trình sinh tổng hợp.

Sợi RNA mới sẽ tách dần khỏi mạch khuôn DNA trừ một đoạn khoảng 12 nu bắt đầu từ điểm tăng trưởng vẫn còn liên kết với DNA.

Phần DNA bị tháo xoắn sau đó sẽ được RNA polymerase xoắn trở lại.

7.3.3. Giai đoạn kết thúc

Khi RNA polymerae kéo dài sinh tổng hợp mRNA tiến đến vùng DNA trên khuôn, nơi có trình tự kết thúc (terminator) (hình 7 - 6). Khi RNA polymerase trượt qua hết trình tự kết thúc thì quá trình sinh tổng hợp mRNA bị ngừng, enzyme RNA polymerase sẽ nhả sợi DNA khuôn ra và sau đó lại có thể hoạt động ở sợi khác. Dấu hiệu kết thúc có thể là một cấu trúc đặc biệt trên sợi khuôn DNA, dài khoảng 30 bp gồm 2 trình tự đối xứng bổ sung dài 7 bp cách nhau một khoảng 7 bp, tiếp đến là trình tự gồm 7 bp là 5’-TTTTTTT-3’.

Vì quá trình tổng hợp RNA luôn lấy sợi đơn hướng 3’-5’ của DNA làm khuôn, nên hướng tổng hợp luôn từ trái sang phải. Kết quả sẽ tạo được sợi mRNA có 2 trình tự đối xứng bổ sung ở trình tự kết thúc, chúng sẽ bắt cặp với nhau để hình thành nên một dạng kẹp tóc “hairpin” ngăn không cho RNA polymerase tiếp tục tổng hợp nữa. Phần sợi khuôn DNA nằm sau RNA polymerase sẽ trở lại cấu trúc ban đầu và tách rời khỏi enzyme. Sợi RNA mới được tổng hợp (hình 7 - 5).

Hình 7 - 5. Trình tự đoạn DNA terminator và cơ chế hình thành nên cấu trúc kẹp tóc kết thúc quá trình phiên mã một gen hay một operon.

Hình 7 - 6. So sánh quá trình dịch mã tạo mRNA và tổng hợp protein giữa

2 sinh vật tiền nhân và nhân thật.

mRNA của sinh vật tiền nhân thường gồm nhiều mRNA cấu trúc ghép lại tạo thành. Đầu 5’ của mRNA bắt đầu dịch mã hoặc phân rã thì đầu 3’ vẫn còn đang phiên mã. mRNA của sinh vật nhân chuẩn là một sợi đơn của một gen, một mRNA mã hoá một polypeptide. Trong quá trình phiên mã, mũ methyl được gắn vào đầu 5’, sau phiên mã xong poly A mới gắn vào đầu 3’. mRNA bắt buộc phải được vận chuyển ra tế bào chất qua lỗ màng nhân, tại đây mới tiến hành quá trình dịch mã.

7.4. QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE

7.4.1. Sự khác nhau trong quá trình phiên mã giữa eukaryote và prokaryote

Đoạn upstream, vùng điều khiển chứa Operator trong chứa Promoter, tiếp đến là vùng downstream, tính từ điểm bắt đầu phiên mã đến điểm kết thúc phiên mã (terminator). Đoạn từ điểm bắt đầu phiên mã đến điểm bắt đầu dịch mó là vùng đầu 5’ downstream không dịch mã (5’UTR). Tiếp đến là vùng dịch mã tạo polypeptide tính từ codon AUG đến một trong bộ 3 codon: UAA, UAG hoặc UGA của vùng terminator. Tiếp theo đến hết đầu 3’ của mRNA trước điểm gắn đuôi polyA lại là một đoạn không phiên mã 3’UTR nữa.

Đặc điểm

Prokaryote

Eukaryote

Số loại RNA polymerase tham gia

Chỉ có một loại mã cho tất cả các gen

Có 3 loại, loại I mã cho rRNA, II cho các mRNA và III cho các tRNA và các RNA nhỏ khác. Loại I nằm trong tổ chức nucleolus, II và III nằm trong chất nhân nucleoplasm.

Phiên mã và dịch mã

Phiên và dịch mã cùng tiến hành

Phiên mã xong rồi mới tiến hành dịch mã

Phiên mã tạo mRNA

Tạo ra mRNA chín ngay, không cần phải qua một giai đoạn biến đổi nào

Phiên mã tạo ra tiền mRNA xảy ra ở trong nhân, biến đổi rồi cắt các intron đi để tạo ra mRNA chín, gồm các đoạn exon ghép nối lại, rồi đi ra ngoài tế bào chất.

Cấu tạo của mRNA

Không có cấu tạo phần đầu và đuôi đặc thù

Đầu 5’ có đính cap 7 methyl Gppp, đầu này được thêm vào trong quá trình phiên mã. Cap 7 N6 Gppp có thể đóng vai trò định hướng cho ribosome bắt đầu dịch mã ở đúng codon AUG. Đầu 3’ có gắn poly A được đính vào sau khi phiên mã (chưa rõ vai trò). Riêng mRNA tạo protein histone thì không có đuôi poly A.

Tổng hợp protein (dịch mã)

Tiến hành ở tại tế bào chất cả hai quá trình phiên mã và dịch mã ra protein

Phiên mã xảy ra ở trong nhân, dịch mã xẩy ra ở tế bào chất, do vậy mRNA chín phải chui qua lỗ nhân để ra tế bào chất.

Quá trình khởi động phiên mã

Đáp ứng tức thì với những điều kiện môi trường biến đổi (xem cơ chế điều hòa)

Không đáp ứng kịp thời với yêu cấu ngoại cảnh thay đổi vì cấu tạo cơ thể là đa bào và cầu trúc phức tạp giữa proten histone với DNA, khởi động chỉ xảy ra sau khi có những thay đổi khiến phức hợp trở lên lỏng lẻo.

Một mRNA

Chứa thông tin di truyền của nhiều gen, mã hóa cho nhiều chuỗi polypeptide nên gọi là polycistron

Một mRNA mã hóa cho một chuỗi polypeptide, mỗi gen phiên mã ra một mRNA. Như vậy một gen bao gồm 3 vùng: Vùng đầu 5’ mang các trình tự điều hòa biểu hiện của gen và hoạt hóa quá trình phiên mã, vùng 2 để phiên mã gồm các intron và exon và vùng 3 chưa xác định được chức năng.

7.4.2. Các giai đoạn phiên mã của Eukaryote

a. Giai đoạn mở đầu

RNA polymerase II bọc lấy một vị trí đặc thù ở promoter. So sánh trình tự của các promoter và vị trí bọc của các RNA polymerase II tương ứng của > 200 gen khác nhau, người ta đã phát hiện thấy chúng đều có 2 trình tự đặc thù nằm ở vị trí bazơ 25 và 75 từ điểm bắt đầu phiên mã (-25 sequence và -75 sequence). Trình tự ở vị trí -25 gọi là hộp Hogness (Hogness box) hay hộp TATA (TATA box), có trình tự là TATAAAA, còn tại vị trí - 75 là GGCCAATCT.

RNA polymerse II bắt đầu hoạt động nhờ nhân tố phiên mã TF (transcriptional factor), có bản chất protein (hình 7-.8). Trước tiên nhân tố TFIID nhận biết và gắn vào trình tự TATAAAA, bước tiếp theo là việc gắn thêm nhân tố TFIIA, lúc đó RNA polymerase liên kết với TFIIB sẽ gắn vào phức hợp TFIID-TFIIA. Khi đó cần một phân tử ATP thủy phân để giải phóng ra năng lượng làm tách sợi DNA kép thành 2 sợi đơn (trạng thái mở), cuối cùng nhân tố TFII E cho phép khởi động phiên mã.

b. Giai đoạn kéo dài

Tương tự như quá trình sinh tổng hợp DNA, chỉ khác là trong thành phần các nucleotide có đường là ribose và chỉ có một sợi đơn (sense) là được copy và thu được một sợii mRNA có trình tự bổ sung. Quá trình này tiến hành từ nhân tố TFIIF (hình 7 - 8). Đính từng nu một vào đầu OH của C3’ của đường ribose và chuỗi mRNA sẽ kéo dài từ đầu 5’ ( 3’ và giải phóng ra hợp chất cao năng NDP.

c. Giai đoạn kết thúc

- Xảy ra tại trình tự kết thúc đặc thù (specific terminator sequence) ở trong phân tử DNA khuôn.

- Ở hầu hết các sinh vật tiền nhân, tận cùng của mRNA đều có trình tự 5’UUUUUUA 3’, chứng tỏ trình tự 3’AAAAAAT 5’ của DNA sợi sense chắc chắn là trình tự điều khiển quá trình kết thúc phiên mã.

- Ngoài ra có một số gen, dấu hiệu kết thúc còn đòi hỏi phải có sự tham gia thêm của một loại protein có tên là rho, một số khác thì có thể không cần.

- Đối với sinh vật nhân chuẩn sự hiểu biết về cơ chế điều khiển quá trình này còn hạn chế, tuy nhiên thường quá trình phiên mã tiến đến trước điểm gắn đuôi poly(A) một đoạn khá xa thì xảy ra cơ chế có liên quan đến việc hình thành cấu trúc dạng kẹp tóc (hairloop structure) tiếp ngay sau đó là vùng giàu CG.

- Kết quả sinh ra đầu tiên của quá trình phiên mã, xảy ra ở trong nhân là tiền mRNA, muốn dịch mã thì tiền mRNA phải “chín hoặc trưởng thành” và di chuyển ra tế bào chất, quá trình này gọi là quá trình chin hay thành thục (maturation) của mRNA.

Hình 7 - 8. Cơ chế khởi động RNA polymerase nhờ các nhân tố phiên mã TF.

a) Đầu tiên phức hợp TFIID ngắn vào hộp TATA qua tiểu đơn vị TBP của mình.

b) Sau đó TFIID gắn ổn định được là bởi phối hợp thêm với TFIIA.

c) Tiếp đến TFIIB và TFIIH kết hợp để cùng tạo thành phức enzyme với RNA polymerase tại TATA.

d) Lúc này RNA polymerase II mới có thể nhập được vào phức hợp các nhân tố phiên mã trên. Cả phức hợp RNA polymerase II,TFIIE và TFIIF được định hình bởi TFIIB và đầu tụ tập carboxyl được bọc bởi TFIID (TFIID-bound CTD), kết quả là quá trình phiên mã bắt đầu xảy ra(e).

d. Quá trình trưởng thành của tiền mRNA sinh vật nhân chuẩn (maturation)

mRNA chín là RNA có thể sẵn sàng tiến hành dịch mã để tạo ra protein. mRNA chín được sinh ra từ tiền mRNA thông qua một số bước sau :

- Cắt bỏ một số lượng lớn các đoạn intron của tiền mRNA tạo thành mRNA thường nhỏ hơn đoạn DNA gen, chỉ gồm các đoạn exon.

- Gắn nhóm 7 methyl guanosine (mRNA cap) vào đầu 5’ của phần tử mRNA.

- Gắn một trình tự dài khoảng 200 adenin nucleotide (poly A tail) vào đầu 3’ của phân tử mRNA, quá trình này được xúc tác bởi enzyme poly A polymerase.

- Hình thành nên phức hợp mRNA với 2 phân tử protein đặc thù.

- Mỗi một gen khác nhau có thể trải qua một vài hoặc tất cả 4 bước trên. Không phải tất cả mọi mRNA đều chứa đầu 5’ cap hoặc poly (A), nên khó xác định được chức năng của quá trình sau phiên mã này.

7.4.3. Quá trình cắt, ghép nối và tạo mRNA chín

- Cắt bỏ trình tự leader (leader sequence) là đoạn không dịch mã của tiền mRNA tính từ nu bắt đầu phiên mã đàu 5’ đến codon đầu tiên (dịch mã).

- Cắt bỏ những trình tự không mã hóa (noncoding sequence hoặc intervening sequence hay intron) chúng nằm ở giữa những đoạn mã hóa exon.

- Hầu hết các gen của sinh vật bậc cao đều chứa những đoạn không mã hóa intron và những đoạn mã hoá exon, một số ít hơn sinh vật nhân thật bậc thấp như nấm enzyme (yeast và Neurospora) cũng chứa vùng này, tiền mRNA chứa toàn bộ cả vùng intron và exon. Các vùng này được cắt bỏ trong quá trình chín của mRNA. Quá trình cắt bỏ phải xảy ra chính xác sau đó việc gắn nối các exon lại cũng phải chính xác để đảm bảo rằng những codon của exon nằm ở ngoài biên với intron được đọc một cách chính xác. Như vậy, đòi hỏi phải có dấu hiệu cắt chính xác, dấu hiệu này có thể là những trình tự nucleotide nằm trong các intron hoặc nằm tại nơi tiếp nối giữa exon với intron. Có một điểm chung là ở nhiều 2 đầu intron có chứa một trình tự 2 nucleotide như sau: Exon (GT…intron…AG) exon.

- Thêm vào nữa người ta đã phát hiện ra một trình tự cầu nối thú vị giữa exon và intron, trình tự này giống nhau ở các mạch DNA sense tạo ra mRNA của nhiều gen theo công thức sau:

….Exon …A64G73) – (G100T100A68A68G84T63….intron… GPy74-87NC65A100G100) – (N….Exon..

- Trong đó exon trước có trình tự đến G73 tiếp đến là trình tự nucleotide của intron giữa đến G100 và cuối cùng là exon kế theo từ nucleotide N. Số liệu 64, 73, 100… ở sau mỗi nu là % tần suất của bazơ đó ở mỗi vị trí tương ứng. Ví dụ =100 tức là lúc nào tại vị trí đó của tất cả các gen cũng là bazơ đó, N là bất kỳ một bazơ nào trong số 4 nu cấu thành.

- Cầu nối này khác nhau đối với những gen tạo ra tRNA và những gen cấu trúc của ty thể và lạp thể. Các gen này có thể có một cơ chế cắt nối khác chưa được sáng tỏ.

- Ngoài ra người ta còn phát hiện thấy có một trình tự nucleotide ngắn nằm ở trong intron của gen ở trong nhân gọi là hộp TACTAAC, nhưng trình tự này ít ổn định dễ biến đổi giữa các gen khác nhau, theo công thức Py80NPy80Py87Pu75A100Py95. Trong đó Adenin ở vị trí số 6 trong hộp TACTAAC có tính ổn định cao, được coi là đóng vai trò quan trọng trong quá trình cắt intron. Trình tự còn lại của intron thường chiếm phần lớn và hay biến đổi mạnh và có trình tự các bazơ ngẫu nhiên.

7.4.4. Kiểu cắt nối RNA

Có 3 kiểu cắt nối sau

- Những intron của tiền tRNA được cắt chính xác bởi enzyme endonuclease và nối lại bởi hoạt tính của những enzyme cắt và nối đặc thù

- Intron của tiền mRNA nhân và tiền rRNA của Tetrachyenzymea thermophila tự động cắt bỏ bởi phản ứng tự hoạt của chính phân tử RNA đó chứ không không cần hoạt tính enzyme protein nào khác (hình 7 - 9).

- Những intron của tiền mRNA nhân được cắt bỏ qua 2 bước phản ứng tiến hành bởi những nhân tố phức hợp, Ribonucleo-protein gọi là spliceosome.

Hình 7 - 9. Sơ đồ mô tả cơ chế tự cắt bỏ intron của tiền rRNA và sự cuộn tròn sau khi cắt của intron nhờ cộng nhân tố guanosinevà trình tự exon

7.4.5. Quá trình cắt ghép nối tiền mRNA

Xảy ra qua 2 bước (hình 7 - 10).

- Bước một cắt tại vị trí đầu 5’ của intron ((GT intron) và hình thành nên cầu nối liên kết phosphodiester giữa cacbon 5’ của G vị trí cắt và cacbon số 2’ của nu A thuộc hộp PyPyPuAPy gần đầu 3’ của intron. Bước này xẩy ra do một cơ quan tử có tên gọi là spliceosome tiến hành, quá trình này cần năng lượng thu được qua quá trình thủy phân ATP.

Spliceosome là một cấu trúc phức giữa RNA và protein trong nhân, những RNA nhỏ này gọi là sn RNAs, còn protein thuộc loại nào thì chưa xác định được. Các snRNA là U1, U2, U4, U5 và U6 chúng có chức năng tham gia vào quá trình cắt nối. Đầu tiên U1 bọc lấy vị trí cắt đầu 5’ của intron trước khi phản ứng cắt tiến hành. Quá trình nhận biết vị trí cắt có thể liên quan đến việc ghép cặp bazơ, giữa trình tự tại vị trí này của intron với trình tự bổ sung gần đầu 5’ của snRNA U1 (hình 7 - 11).

Hình 7 - 10. Sơ đồ hai bước cắt intron của tiền mRNA (hnRNAs).

Quá trình cắt xảy ra ở spliceosome. Bước một cắt chính xác tại đầu 5’ của intron sau đó hình thành nên liên kết 2’-5’ phosphodiester giữa vị trí 5’ của Guanosine tại điểm cắt với nu A bảo thủ nằm gần đầu 3’ trong intron. Exon 1 được giữ lại tại một chỗ nhờ các thành phần của spliceosome. Bước 2, 2 exon kết hợp với nhau bằng liên kết 3’ - 5’ phosphodiester thành hình dạng thòng lọng được giaỉ phóng ra.

Hình 7 - 11. Sơ đồ biểu diễn vai trò của những protein ribonucleotit trong nhân nhỏ chứa RNA nhỏ (snRNA-containing snRNP) trong quá trình cắt 2 bước intron của tiền mRNA.

- Bước một protein U1 chứa snRNA bọc lấy và cắt tại vị trí 5’ của intron làm rời exon 1 ra, sau đó U1, U2, U3, U4 và U5 phối hợp với nhau để tạo thành một phức hợp tại vị trí cắt ở đầu 3’ intron rồi cuộn intron lại thành một cái vòng. Bước 2 phức hợp cắt đứt đầu 3’ và nối 2 exon lại.

Tuy nhiên, tính đặc thù của quá trình bọc giữa sn RNA với intron còn liên quan đến cả 2 snRNA và protein đặc thù khác với nó nữa.

- Bước 2 snRNA U2 bọc lấy vị trí A, hình thành lên một cấu trúc lariat (dây thòng lọng) ở hình 7 - 12.

Sau đó snRNA U5 bọc vào vị trí cắt đầu 3’, rồi tiếp đến U4 hoặc U6 được gắn vào phức hợp để tạo thành một spliceosome hoàn chỉnh. Khi vị trí đầu 5’ của intron bị cắt ở bước một thì U4 được giải phóng khỏi spliceosome tạo ra exon 1 có đầu 3’ là G-OH ở bước 2 vị trí đầu 3’ của intron bị cắt tạo ra intron tự do hình thòng lọng. Cuối cùng 2 exon kết đính lại với nhau bằng liên kết 5’ - 3’ phosphodiester, như vậy mRNA lúc này sẵn sàng ra khỏi nhân qua lỗ màng nhân rồi vào tế bào chất để thực hiện quá trình dịch mã tạo protein.

Trình tự 5’ của intron (5’-GUAAGU-3’) bổ sung với trình tự gần đầu 5’ của U1 snRNA. Ký hiệu: nu nào có m là nu đó bị methyl hoá. U1 snRNA chứa mũ trimethyl G gắn cạnh Am bằng liên kết 5’-5’ triphosphate giống như hầu hết các mRNA của sinh vật nhân chuẩn khác.

Hình 7 - 12. Cấu trúc bậc 2 của snRNA U1 và khả năng ghép cặp với trình tự

đầu 5’ của intron tiền mRNA nhân.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Nêu và phân tích những đặc điểm giống và khác nhau giữa quá trình tổng hợp DNA và RNA.

2. Quá trình phiên mã xẩy ra ở prokaryote như thế nào, đặc điểm của enzyme RNA polymerase và vai trò của trình tự promoter trong phiên mã gen.

3. Sự khác và giống nhau trong quá trình phiên và dịch mã giữa 2 sinh vật Prokaryote và Eukaryote, nguyên nhân.

4. Quá trình phiên mã gen ở Eukaryote có khác gì so với Prokaryote không.

5. Khi nào xẩy ra hiện tượng khuyếch đại và đối mã gen, nêu cơ chế phân tử.

6. Nêu đặc điểm cấu trúc gen và trình tự cầu nối exon –intron lên quan đến quá trình cắt nối tạo mRNA chín.

7. Spliceosome là gì. Nêu vai trò của snRNA trong quá trính cắt nối mRNA chín.

8. Cơ chế xâm nhiễm Vi rút HIV vào cơ thể người như thế nào. Tại sao bệnh AIDS khó chữa.

9. Hộp Hogness là gì, có thể tăng cường hoạt hoá gen thông qua tạo trình tự tương đồng với hộp Hogness được không, trường hợp nào được và khả năng là bao nhiêu.

10. Trình tự hai đầu tận cùng mRNA của sinh vật tiền nhân và nhân chuẩn có gì khác nhau không. Cấu trúc này có liên quan đến cơ chế dừng phiên mã không.

11. Nêu đặc điểm giống và khác nhau giữa quá trình tổng hợp DNA, RNA và protein. Nếu muốn tổng hợp in vitro các chất trên thì chất nào dễ hơn tại sao.

Chương 8 MÃ DI TRUYỀN VÀ DỊCH MÃ

Tiếp theo phiên mã là quá trình dịch mã tổng hợp protein, khâu cuối cùng trong quá trình biểu hiện của gen. Trong chương này chúng ta sẽ đề cập đến cơ chế tổng hợp protein từ mRNA. Giải thích được quá trình này chúng ta có thể hiểu được mối quan hệ giữa trình tự DNA gen đến trình tự amino acid của phân tử protein và lý giải tại sao sự thay đổi trong trình tự các nucleotide có thể dẫn đến tạo ra một polypeptide mới , một enzyme chức năng mới hay một tính trạng mới. 8.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong chương trước chúng ta sẽ đề cập đến quá trình truyền đạt thông tin di truyền từ DNA (gen) ( mRNA gọi là quá trình phiên mã. Chương này sẽ đề cập đến cơ sở phân tử của quá trình dịch mã từ mRNA ​( protein. Như vậy thì mRNA là giai đoạn trung gian giữa DNA và protein, giúp truyền thông tin mã hóa từ DNA ra bộ máy dịch mã để tạo thành polypeptide. Từ một gen có thể tổng hợp được nhiều bản sao mRNA, như vậy thông tin của một gen duy nhất có thể khuếch đại sẽ tạo ra một số các polypeptide khác nhau. Quá trình sinh tổng hợp protein cũng giống như quá trình sinh tổng hợp DNA và mRNA có thể tóm tắt như sau:

Chỉ tiêu tổng hợp

DNA và RNA

Protein

Đơn vị cơ bản

4 nucleotide

20 loại amino acid

Quá trình tổng hợp và kéo dài mạch

Nối kết dần dần (kéo dài) từng nu.

Nối kết dần dần từng amino acid

Sự bắt đầu và kết thúc

Bắt đầu tại một điểm và kết thúc tại một điểm.

Cũng bắt đầu tại một điểm và kết thúc tại một điểm

Độ phức tạp

Quá trình sao chép và phiên mã ít phức tạp hơn, chủ yếu dựa vào ái lực giữa các bazơ thành phần câú tạo nên phân tử mới với các bazơ khuôn thông qua liên kết hydro.

Quá trình dịch mã rất phức tạp. Từng amino acid được nối với nhau thông qua khuôn mRNA nhưng lại không có ái lực với mRNA, hơn thế nữa những nhánh bên của amino acid lại bị đẩy bởi nhiều nhóm các bazơ.

Cần đòi hỏi

Khuôn DNA và mRNA cộng với các bazơ nitơ NTP.

Khuôn mRNA cộng với các amino acid và nhân tố tiếp hợp (adaptor) là tRNA. Quá trình dịch mã được tiến hành chung cho mỗi loại tế bào.

8.2. VAI TRÒ CỦA 3 LOẠI RNA TRONG TỔNG HỢP PROTEIN

8.2.1. mRNA và mã di truyền

Mỗi phân tử mRNA mang thông tin di truyền xác định trình tự một polypeptide, thông tin này được sao chép từ DNA của một gen qua quá trình phiên mã. Vậy làm thế nào trình tự 4 cặp bazơ trong DNA có thể kiểm tra được trình tự 20 amino acid. DNA và mRNA đều được cấu tạo từ 4 nucleotide, trong khi protein được hình thành từ 20 amino acid, như vậy thông tin di truyền mã hoá từ DNA thành mRNA phải dưới dạng một tổ hợp như thế nào của 4 loại nu để giải mã cho 20 amino acid cấu thành nên protein. Vì rằng có 20 amino acid nhập vào để tạo nên protein thì ít nhất cũng phải có 20 mã codon tạo thành từ 4 bazơ. Giả sử nếu tổ hợp 2 nu mã hóa 1 amino acid thì sẽ được 42 = 16 mã codon, như vậy vẫn nhỏ hơn nhu cầu thực tế là 20 mã (codon). Nếu tổ hợp 3 nu mã hóa một amino acid thì được 43 = 64 codon.

Vào những năm 1960 người ta đã thiết lập được hệ thống tương ứng giữa tổ hợp số các nu với từng axít amin. Hệ thống này có tên là mã di truyền (codon), là bộ 3 nucleotide trên phân tử mRNA được trình bầy ở bảng 8 - 1.

Theo bảng mã di truyền chúng ta có thể rút ra một số điểm sau:

- Số lượng codon có thể có nếu mã codon có 3 nu là 64, lớn hơn số lượng amino acid (20). Do vậy một amino acid có thể được mã hóa bởi nhiều bộ 3 codon, người ta gọi là hiện tượng mã di truyền có tính suy thoái.

- Tính suy thoái của mã di truyền có ý nghĩa tích cực, đối với sự sống còn của tế bào, đối với nhiều amino acid có nhiều codon mã hóa thì dù một trong số ba nu của các codon đó bị đột biến nhưng có thể amino acid do nó mã hóa không bị biến đổi theo và protein mang amino acid này vẫn giữ được cấu trúc và chức năng nguyên vẹn. Thường những amino acid được mã hóa bởi nhiều codon thì thường xuất hiện với tần số lớn trong chuỗi polypeptide. Những protein enzyme có nhóm chức ở những vị trí amino acid thuộc loại này thì ít bị thay đổi tính chất hơn.

- Các codon khác nhau cùng mã hoá một amino acid, thường chúng chỉ khác nhau ở nu thứ 3 của codon, người ta gọi là hiện tượng suy thoái codon, có 2 dạng suy thoái là: suy thoái cục bộ và suy thoái hoàn toàn.

+ Suy thoái cục bộ (partial degenracy): xảy ra khi bazơ ở vị trí thứ 3 hoặc là một trong 2 pyrimidine (U và C) hay một trong 2 purine (A và G), nếu thay nu thứ 3 từ một purine sang một pyrimidine và ngược lại sẽ làm thay đổi amino acid mà mã đó mã hoá.

+ Suy thoái hoàn toàn (complete degeneracy): xảy ra trong trường hợp bất kỳ một trong 4 bazơ có thể có mặt tại ví trí nu thứ 3 của codon thì codon đó vẫn mã đặc thù cho cùng một amino acid, trường hợp 4 codon cùng mã hóa một amino acid.

- Có thể dự đoán rằng trật tự trong mã di truyền có liên quan đến cách làm giảm tối thiểu những đột biến gây chết, nhiều cách thay thế bazơ ở vị trí thứ 3 của codon không làm thay đổi amino acid mà nó mã hóa. Hơn thế nữa những amino acid có tính chất hóa học tương tự nhau như leucine, isoleucine và valine có những codon khác nhau chỉ một bazơ. Bởi vậy rất nhiều trường hợp thay thế cặp bazơ đơn sẽ dẫn đến việc thay thế một amino acid này bằng một amino acid khác có đặc tính hóa học tương tự (thí dụ valine thay bằng isoleucine).

Bảng 8 - 1. Mã di truyền và suy thoái mã

- Do hiện tượng suy thoái codon cho nên chắc chắn một tRNA có thể nhận biết vài codon khác nhau để mã hóa cho một amino acid nhất định, và đối mã của một tRNA nhất định phải có khả năng ghép cặp bazơ với vài codon khác nhau. Như vậy liên kết hydro giữa 2 bazơ của codon và anticodon chỉ chặt chẽ (theo luật bổ sung nghiêm khắc) ở 2 nu đầu, còn nu thứ 3 của codon thì ít chặt chẽ hơn, chính vì thế Crick đã gọi vị trí này là vị trí lắc lư “wobble” hay giao động. Thuyết giao động (wobble hypothesis), bảng 8 - 2. chỉ ra rằng:

Bảng 8 - 2. Ghép cặp bazơ giữa bazơ đầu 5’ của anticodon trên tRNA với bazơ đầu 3’

của codon trên mRNA theo giả thuyết giao động.

Base 5’ in anticodon

Base 3’ in codon

G

U or C

C

G

A

U

U

A or G

I

A, U or C

Có ít nhất 2 tRNA cho mỗi amino acid mà codon của nó biểu hiện suy thoái hoàn toàn ở vị trí thứ 3. Thực tế chứng minh rằng có 3 tRNA đối mã với 6 codon serine đó là: tRNA ser. 1 có anticodon là AGG có thể bọc lấy được 2 codon UCU và UCC trên mRNA ; tRNA ser. 2 có anticodon là AGU sẽ bọc được các codon UCA và UCG và tRNA ser 3 mang anticodon UCG sẽ bọc lấy các codon AGU và AGC.

Hình 8 – 1. Sơ đồ mã codon quy định amino acid

Hình 8 - 2. Trình tự nu và cấu hình 3 lá của tRNA vận chuyển alanine (trái) và

của methionine (phải) của nấm men.

- Tính đặc thù này bị biến đổi bởi quá trình bọc của những tRNA, gắn amino acyl vào ribosome ở in vitro được kích thích bởi trinuleotide.

- Một số tRNA chứa bazơ hiếm (inosine) được tạo thành bởi quá trình biến đổi của enzyme sau phiên mã. Nếu inosine nằm ở vị trí giao động có thể ghép cặp được với A, U hoặc cytosine của codon trên mRNA. Trong thực tế những alanyl-tRNA tinh khiết chứa inosine (I) tại vị trí 5’ của anticodon sẽ bọc với ribosome hoạt hóa với gcu, gcc hoặc gca.

Cấu trúc bậc 2 được hình thành nhờ cầu nối hydro giữa các bazơ ở những đoạn khác nhau. Trong cấu trúc có 3 vòng, một trong chúng có chứa trình tự anticodon CAU đối với alanine, còn đối với methionine thì trình tự anticodon là 3’-CGI-5’. Tên và vị trí các nu biến đổi được chú giải như hình vẽ trên.

8.2.2. Mã mở đầu và kết thúc

- Có 3 mã codon đặc thù kết thúc dịch mã tạo chuỗi polypeptide là UAA, UAG và UGA. Những mã này được nhận biết bởi những nhân tố giải phóng protein chứ không phải là tRNA. Một trong chúng đó là protein RF-1 đặc thù cho UAA và UGA codon. Còn RF-2 làm kết thúc dịch tạo protein tại UAA và UGA codon. 2 codon AUG và GUG được nhận biết bởi tRNA khởi đầu cho methionine (tRNAi met lúc này bazơ wobble lại ở đầu 5’). Nhưng chỉ biểu hiện được đặc tính làm khởi đầu khi chúng đi sau một trình tự các nu thích hợp ở vùng leader của phân tử mRNA, còn tất cả các protein của mọi sinh vật đều có đầu COOH là amino acid methionine. Ở những vị trí nội vi thì các codon AUG được nhận biết bởi tRNAMet . Codon GUG được nhận biết bởi valine tRNA. Trong trường hợp có 2 mã khởi đầu là AUG và GUG, thì bazơ đầu 5’ của codon sẽ là bazơ dao động. Vì tính dao động là ở bazơ đầu 5’ duy nhất để khởi đầu nên điều này có liên quan đến việc ghép cặp bazơ ở vị trí P (Peptidyl-tRNA binding site) hơn là ở vị trí A (aminoacyl-tRNA binding site) trên ribosome.

- Tính phổ biến của mã di truyền: rất nhiều nghiên cứu đều kết luận rằng mã di truyền giống nhau hoặc rất gần giống nhau ở tất các các loài sinh vật. Có một số trường hợp ngoại lệ xảy ra ở ty thể người, nấm enzyme và một số loài khác, ở đó mã UGA quy định tryptophane khác so với ngoài ty thể thì mã này lại là mã kết thúc. Ở ty thể của nấm enzyme, codon CUA sẽ mã hóa cho threonin thay bằng bình thường là leucine. Trường hợp ở ty thể động vật có vú, codon AUA lại mã hóa cho methionine thay bằng bình thường là isoleucine.

- Có một số đột biến (đột biến ức chế) ở những gen tRNA dẫn đến làm thay đổi vị trí nhận biết codon của anticodon của tRNA.

8.2.3. RNA vận chuyển (tRNA)

- Phân tử tRNA vận chuyển amino acid đến chuỗi polypeptide đang kéo dài trong quá trình dịch mã. Phân tử tRNA là loại nucleic acid hoạt động sinh học nhỏ nhất. Thí dụ tRNA vận chuyển alanine của nấm enzyme chỉ có 77 nu, được cuộn lại để tạo thành một hình cỏ 3 lá, do xẩy ra quá trình ghép cặp giữa G(C và A=U. Tất cả các tRNA đều có đính amino acid ở đầu 3’ thứ tự ở đây là 5’-ACCA-3’OH adenylic còn đầu 5’ luôn luôn là guanylic acid (G), C là cytidilic. tRNA có chứa một số purine và pyrimidine hiếm không phổ biến ở các RNA khác. Các bazơ hiếm được tạo thành sau phiên mã vì ở trong nhân có chứa một số enzyme có khả năng làm biến đổi một số bazơ nhất định. Vị trí anticodon nằm từ nu thứ 36 - 38, các bazơ hiếm là (: pseudouridynic acid; T: ribothymidylic acid; Ud :dihydrouridilic acid; Gm: methyl guanydilic acid; Gd: dimethylguanylic acid; I: Inosinic acid và Im: methyl inosinic acid.

- tRNA là nhân tố tiếp hợp hay trung gian, có một đầu chứa trình tự 3 nu đối mã với 3 nu của codon trên phân tử mRNA gọi là anticodon còn đầu kia mang amino acid sẽ kết nối để tạo thành chuỗi protein.

- Mỗi sinh vật tiền nhân có một số lượng tRNA khác nhau, thường có từ 30 - 40, còn ở động thực vật là 50, nhưng đều có cấu trúc rất giống nhau.

- Một tRNA có thể kết hợp được với hơn 2 codon khác nhau, cùng mã hóa cho một amino acid.

- Chức năng trung gian của tRNA được thực hiện nhờ một số enzyme đặc biệt, đó là các enzyme aminoacyl- tRNA synthetase, có 20 loại enzyme, tương ứng với 20 amino acid. Các enzyme này có khả năng nhận biết một amino acid đặc thù và cả tRNA tương ứng vận chuyển amino acid đó. Quá trình gắn amino acid vào tRNA là quá trình cần tiêu tốn năng lượng và trải qua 2 bước:

+ Bước 1: Enzyme nhận biết và gắn với một amino acid đặc thù theo công thức: enzyme + amino acid + ATP ( enzyme – aminoacyl –AMP +P-P.

+ Bước 2: Amino acid được chuyển từ phức hợp trên sang tRNA tương ứng. Sau đó phức hợp enzyme – aminoacyl –AMP tương tác với tRNA để tạo thành tRNA –amino acyl và giải phóng ra AMP và enzyme.

8.2.4. RNA ribosome (rRNA)

Hiệu năng của quá trình dịch mã là một triệu liên kết peptide trong một giây, nếu chỉ dựa vào sự va chạm ngẫu nhiên giữa các thành phần tham gia phản ứng xúc tác thì để tạo được một liên kết peptide là cực hiếm. Muốn vậy thì mRNA và tRNA –amino acid phải được đặt vào một vị trí có thế tiếp xúc phản ứng tối thích, vị trí đó là phức hợp ribonucleoprotein: ribosome. Ribosome được cấu tạo từ rRNA và hơn 50 loại protein khác nhau, phân thành 2 tiểu đơn vị. Tiểu đơn vị lớn chứa 1 rRNA lớn còn tiểu đơn vị nhỏ chứa 1 rRNA nhỏ. Trừ một vài sai khác về kích thước và thành phần, ribosome cũng như rRNA của sinh vật tiền nhân và nhân thật về cơ bản là giống nhau (hình 8 - 3).

Hình 8 - 3. Cấu trúc ribosome và cơ chế kết gắn và thứ tự di chuyển từ vị trí A đến P khi dịch mã của các tRNA mang amino acid tương ứng với codon

8.3. CÁC GIAI ĐOẠN SINH TỔNG HỢP PROTEIN

8.3.1. Mở đầu

Protein bắt đầu tổng hợp từ codon AUG nằm trên phân tử mRNA, mã hóa methionine tương ứng tRNAMet . Như vậy, trong quá trình tổng hợp tất cả các polypeptide đều có amino acid bắt đầu bằng methionine. Sau đó amino–terminal methionine này bị cắt khỏi nhiều polypeptide. Phần lớn những protein có chức năng cần thiết đều không có amino-terminal methionine. Ở sinh vật tiền nhân và nhiều cơ quan tử của sinh vật nhân thật, methionine ở tRNAMet có nhóm amin bị khóa bởi nhóm formyl (-COH). Có 2 loại tRNA là:

+ tRNAMet kết hợp với AUG codon nằm giữa mRNA.

+ tRNAiMet kết hợp với AUG codon khởi đầu, có nhiệm vụ gắn methionine đầu tiên vào chuỗi polypeptide.

Tuy nhiên, ở sinh vật nhân thật nhóm amino của methionyl –tRNAMet không bị khóa lại. Vậy điều gì đã ngăn cản methionyl-tRNAiMet khởi đầu không phản ứng với mã AUG bên trong mRNA mà lại chỉ phản ứng được với codon AUG khởi đầu của mRNA. Để làm được điều đó thì methionyl tRNAiMet phải tương tác với một số nhân tố khởi đau như: IF-1, IF-2 và IF-3. Trong khi đó methionyl-tRNAMet thì lại cần phải tương tác với những protein nhân tố kéo dài có tên gọi là Ef-Ts và Ef-Tu.

- Ở sinh vật tiền nhân, chuỗi polypeptide khởi động quá trình tổng hợp đầu tiên với việc hình thành một phức hợp giữa mRNA, Methionyl – tRNAfMet và tiểu đơn vị ribosome 30S (hình 8 - 4). Quá trình hình thành phức hợp khởi đầu này cần yêu cầu sự hoạt hóa của 3 nhân tố khởi động là: IF-1, IF-2 và IF-3 và GTP để cung cấp năng lượng. Quá trình này có thể được trợ lực bằng mối tương tác cặp bổ sung giữa trình tự bazơ gần đầu 3’ của 16S rRNA với trình tự bazơ ở đoạn leader của mRNA, là đoạn không dịch mã tính từ đầu 5’ đến mã AUG hoặc GUG khởi động. Đoạn này biến động nhiều về chiều dài từ vài nucleotide đến vài trăm nucleotide.

- Phức hợp mở đầu sau đó kết hợp với tiểu đơn vị ribosome 50S và methionyl-tRNAfMet trở lên có khả năng bọc lấy được vị trí P (hình 8 - 4 bc). Quá trình này cần thủy phân một phân tử GTP. Đối mã giữa codon khởi đầu AUG với anticodon của tRNAMet ở tại P đã giữ codon tiếp có mặt tại vị trí A, bởi thế đã hình thành nên tính đặc thù bao bọc lấy aminocyl-tRNA, tại đây tương ứng với amino acid alanine (hình 8 - 3d). Quá trình bọc này lại yêu cầu thủy phân một phân tử GTP kết hợp với những nhân tố kéo dài Ef-Ts và Ef-Tu (hình 8 - 4d và c). Liên kết peptide được hình thành giữa nhóm COOH của f methionine được gắn trong tRNAfMet tại vị trí P với nhóm amino của alanine trong tRNAala ở vị trí A bởi enzyme peptidyl transferase, enzyme này bọc lấy tiểu đơn vị lớn 50S (hình 8 - 4d và e).

Hình 8 – 4.1. Sơ đồ các bước dịch mã tạo protein từ mRNA và ribosome từ a - d.

8.3.2. Kéo dài

- Tiến hành đơn giản trên cơ sở nguyên lý lặp lại (hình 8 - 4). Sau khi Met được đặt vào vị trí đầu tiên của chuỗi peptide thì aminoacyl–tRNA kế tiếp có anticodon tương ứng với codon kế tiếp của mRNA sẽ đến xếp vào đúng vị trí trên ribosome nhờ một trong các tác nhân kéo dài EF.

- Có 2 vị trí đặc biệt trên tiểu ribosome nhỏ là vị trí A tiếp nhận aminoacyl-tRNA kế tiếp và vị trí P giữ phức hợp peptidyl-tRNA là chuỗi polypeptide đang hình thành vẫn còn gắn với tRNA ngay trước đó.

- Sự tiếp xúc giữa peptidyl-tRNA và aminoacyl –tRNA sẽ dẫn đến sự hình thành nên liên kết peptide gắn amino acid mới vào chuỗi polypeptide.

- Sự di chuyển của mRNA sau 0,5 giây đi được đúng 3 nucleotide của một codon, như vậy nếu codon trước ở vị trí A thì sau 0,5 giây sẽ chuyển sang vị trí P (hình 8 - 4 e và f), ở 2 hình này là codon alanine GCC. Codon tiếp theo là serine UCC dịch đến A, quá trình chuyển vị cần hoạt tính của nhân tố kéo dài Ef-G và thủy phân một phân tử GTP. Aminoacyl-tRNA tiếp theo đặc thù cho codon trên mRNA nằm ở vị trí A (hình 8 - 4 f và g) sẽ bọc lấy A và liên kết peptide mới được hình thành. Quá trình này được lặp lại cho đến khi gặp phải dấu hiệu kết thúc dịch mã.

Hình 8 – 4.2. Tiếp các bước kéo dài chuỗi protein từ e-i.

8.3.3. Kết thúc

- Khi ribosome tiến đến và nhận biết dấu hiệu kết thúc dịch mã đó là vị trí có một trong số 3 codon UAG, UAA, UGA) (hình 8 - 4 g và h). Nhóm formyl của amino terminal methionine thường bị loại bỏ nhờ enzyme deformylase (hình 8 - 4 g và h) trước khi tổng hợp chuỗi polypeptide kết thúc.

- Khi một trong ba codon kết thúc trên tiến vào vị trí A (hình 8 - 4h) thì chuỗi polypeptide, tRNA ở vị trí P thì mRNA sẽ tách rời nhau khỏi ribosome và 2 tiểu đơn vị ribosome tách nhau ra (hình 8 - 4 h và i). Quá trình kết thúc đòi hỏi cần có sự tham gia của 1 trong 2 protein, đó là nhân tố giải thoát kí hiệu là: RF-1 và RF-2. Hai tiểu ribosome tách rời nhau, trở lên tự do sẵn sàng bước vào một chu kỳ bắt đầu dịch mã mới.

8.3.4. Biến đổi sau dịch mã

Protein sau dịch mã được biến đổi tiếp để trở thành dạng hoạt động theo các nhu cầu.Sự biến đổi bao gồm các quá trình sau:

- Ở vi khuẩn xảy ra quá trình loại bỏ gốc formyl của phân tử protein.

- Loại bỏ một vài amino acid đầu tiên nhờ enzyme amino peptidase.

- Gắn thêm đường vào protein (glyco sylation) giúp quá trình định hướng di chuyển và hoạt động của prpotein.

- Gắn gốc phosphat (phospho rylation) vào protein bởi enzyme kinase.

- Hình thành các liên kết disulphate (S - S) giữa các polypeptide tạo thành một protein phức hoặc enzyme phức hoạt động.

- Cắt bỏ một đoạn polypeptide có thể xảy ra như sau:

Loại bỏ peptide di chuyển (transit peptide), quá trình này xảy ra tùy protein chuyển vị vào cơ quan, tổ chức nào của tế bào và mô nào.

Loại bỏ trình tự tín hiệu của protein giúp chúng tiến vào mạng lưới nội chất hạt (ER)

Có thể cắt bỏ polypeptide để tăng hoạt tính của enzyme.

8.4. Thực hành xác định các thành phần của một gen

Từ quy luật mã di truyền và quy luật cấu trúc các trình tự của gen mà chúng ta có thể:

- Từ một trình tự đoạn DNA gen ta có thể dự đoán được đoạn nào là promoter, đoạn nào là các exon, intron, đoạn nào sinh ra mRNA, trong đó đoạn nào dịch mã và không dịch mã, đầu 5’ UTR và 3’ UTR, đoạn nào là trình tự kết thúc, đoạn nào chứa trình tự gắn poly A và cuối cùng là chuỗi polypeptide chứa trình tự amino acid đầu cacboxyl và amin, có cả phần mềm xác định các nhóm chức, pH điểm đẳng điện và có thể biết được tỷ lệ từng loại amino acid và hoạt tính có thể của nó.

- Ngược lại nếu biết trước được trình tự amino acid của một polypeptide chúng ta có thể suy ngược lại trình tự các nu trong khung đọc mở, tuy nhiêu độ chính xác phụ thuộc vào hiện tượng suy thoái mã codon. Muốn xác đinh trình tự chính xác chúng ta phải dò các khả năng mã codon khác nhau đặc biệt các nu ở đầu 3’ của codon, rồi dùng làm mẫu dò để lai với DNA của đoạn gen tương ứng.

Thực hành thao tác tìm các trình tự điều khiển của gen amylase 3D phân giải tinh bột ở lúa như sau:

Cho biết một số trình tự cấu trúc của gen này như sau:

Trình tự TATA box: 5’ TATATATA 3’ hoặc 5’TATATATG3’;

Vị trí chuyển mã là: 5’ CTCATC 3’ hoặc 5’ATCATC 3’;

Vị trí giải mã có trình tự là: 5’TAAACAATGGCT3’ hoặc 5’ ACAGATATGAAG 3’;

Vị trí đầu cắt ở đầu 5’ của các intron là: AG/GTAAG hoặc AG/GTACG hay TC/GTAAG;

Vị trí đầu cắt ở đầu 3’ của các intron là: TGCAG/ hoặc GGCAG/;

Dấu hiệu gắn đuôi Polyadenylation vào phân tử mRNA có trình tự là một trong 3 trình tự sau: AATAAA hoặc AATAAG hay AGTAAA.

Gen này dài 2938 bp bao gồm cả trình tự promoter, đoạn 5 UTR và 3 UTR, các đoạn intron và exon và cả đoạn gắn polyA, terminator và cả trình tự a.amin chuỗi polypeptide của enzyme.

Hình 8-5. Trình tự DNA của gen và chuỗi a.amin enzyme Amylase 3D

8.5. TÓM TẮT

Một số nét chính liên quan đến đặc điểm phiên và dịch mã gen:

- Khi kích thước genome của sinh vật tăng nên thường là do kích thước của các intron tăng.

- Intron thường dài hơn exon, biến động từ 200 bp (dài bằng một exon) đến tới 10 kb, có trường hợp dài đến 50 – 60 kb.

- Hầu hết các exon đều mã hoá ít hơn 100 amino acid, ở động vật có xương sống có trường hợp một exon mã hóa ít hơn 50 amino acid, ở nấm một exon có thể mã hóa trên 300 amino acid.

- Ở hầu hết các loại nấm men, các gen không chứa đoạn ngắt intron, ngược lại ở sinh vật bậc cao: ruồi và động vật có vú trong một gen có chứa nhiều đoạn intron.

- Do cách thức cắt nối intron, exon khác nhau nên một trình tự DNA (gen) có thể mã hoá và tạo thành hơn một protein.

- Hai protein có thể sinh ra từ một gen do cơ chế bắt đầu biểu hiện và kết thúc ở những vị trí khác nhau.

- Hai gen có trình tự giống nhau nhưng khung bắt đầu đọc DNA ở vị trí khác nhau sẽ sinh ra các mRNA khác nhau.

- Các gen có những đoạn chồng chéo nhau, kết quả phiên mã có thể tạo ra mRNA có một phần giống nhau.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1. Mã di truyền, suy thoái mã, suy thoái hoàn toàn và suy thoái cục bộ. Ý nghĩa trong việc bảo tồn tính ổn định di truyền sinh vật, liệu có thể dự đoán được trình tự gen trên cơ sở biết được tình tự amino acid không.

2. Tại sao methionyl- tRNAiMet ở sinh vật nhân thật không phản ứng với mã AUG bên trong mRNA mà lại phản ứng với AUG codon khởi đầu của mRNA.

3. Vai trò của hai tiểu phần Ribosome trong quá trình tổng hợp protein. Lúc nào 2 tiểu phần này dính vào nhau và nhờ yếu tố gì.

4. Nêu tóm tắt quá trinh sinh tổng hợp protein ở sinh vật nhân thật.

5. Tìm các vị trí trình tự đặc thù của gen sinh ra enzyme Amy 3A phân giải tinh bột ở lúa.

Cấu tạo hoá học của Purine

Cấu tạo hoá học của pyrimidine Pyrimidine

H2N-CH-COOH

R

Tinh bột

� INCLUDEPICTURE "http://rds.yahoo.com/_ylt=A0Je5xdYBbdEcw4AUUWjzbkF;_ylu=X3oDMTA4NDgyNWN0BHNlYwNwcm9m/SIG=12o12srp4/EXP=1152931544/**http%3a/hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/Organic/imgorg/starch.gif" \* MERGEFORMATINET ���

Glucose

5’

3’

Intron

Exon

Tín hiệu chuyển peptit

Vị trí gắn riboxom

Hộp TATA

Hộp AGGA/CAAT

UAA, UAG, UGA

Kết thúc dịch mã

Bắt đầu dịch mã

Bắt đầu phiên mã

AUG

AATAAA Tín hiệu poly A hóa

Kết thúc

phiên mã

Vùng upstream

Vùng downstream

Promoter

Khung đọc mã

Hộp CAAT

Hộp TATA

Bắt đầu phiên mã

-75

-25

+1

Vùng trình tự của gen điều khiển

GGCCAATCT

TATAAAA

DNA

5’

3’

Loài

DNA tổng số (bp)

Số nhiễm sắc thể (2x)

Số lượng gen

Vi khuẩn (Escherichia coli)

Nấm men (Saccharomyces cerevisiae)

Tuyến trùng(Caenorhabditis elegans)

Thực vật (Arabidopsis thaliana)

Ruồi dấm (Drosophila melanogaster)

Lúa nước (Oryza sativa)

Chuột (Mus musculus)

Người (Homo sapiens)

4.639.221

12.068.000

97.000.000

125.000.000

180.000.000

480.000.000

2.500.000.000

3.200.000.000

1

16

12

10

18

24

40

46

4.405

6.200

19.000

25.500

13.600

57.000

30.000-35.000

30.000-35.000

Gen điều hòa

O

DNA

P

I

Y

A

Promoter

Gen operator

Các gen cấu trúc

5’

3’

3’

5’

z

Hộp Pribnov

Bắt đầu phiên mã

-35

-10

+1

TTGACA

TATAAT

DNA

5’

3’

Vùng -35

Retroposon

RNA

cDNA

Retroposon (cũ)

Retroposon(mới)

Phiên mã

Phiên mã ngược

Tái tổ hợp

LTR

gag

LTR

env

pol

~7 kb

Hình 4 - 9. Cấu trúc di truyền của retrovirus

LTR

gag

LTR

pol

~7 kb

+ Ty1/copia retrotransposon

LTR

gag

LTR

env

pol

~7 K KBkb

NhómTy3 ỏTY3/ TY3/gy

gag

pol

poly A

~6 kb

LTR

gagg

LTR

pol

~7 kb

Ty1/copia retrotransposon

poly AA

~0,3 kb

poly A

~0,3 kb

SINE

gag

pol

poly A

~6 kb

LINE 1

Vị trí nhận

Vị trí nhận

Vị trí cho

Vị trí cho

Vị trí nhận

Vị trí cho

Cơ chế tự tái bản, số lượng transposon tăng lên sau mỗi lần sao chép

Cơ chế bảo tồn, số lượng transposon không tăng lên

a

1

c

d

b

Ac

5

4

3

2

4563bp

11bp

11bp

4563bp

Ac

11bp

11bp

Ac

4563bp

11bp

11bp

Ds9

4369bp

11bp

11bp

( 194 bp

Ds6

2042bp

11bp

11bp

( 2521 bp

ITR

ITR

Transposase

~0,3kb kbkb

IS

Gen tổng hợp

IS

+ Composite transposon

2,5~10 kb

Gen kháng kháng sinh

Transposase

Resolvase

ITR

ITR

+ Transposon dạng Tn3

~5 kb

ITR

ITR

Gen lysis

Gen tổ hợp và tái bản

Gen protein vỏ

+ Transposable phage

~38 kb

ACAGTTCAG

TGTCAÂGTC

CTGAACTGT

GACTACACA

TCGAT

AGCTA

ACAGTTCAG

TGTCAAGTC

CTGAACTGT

GACTACACA

ACAGTTCAG

TGTCAÂGTC

CTGAACTGT

GACTACACA

TCGAT

AGCTA

TCGAT

AGCTA

TCGAT

AGCTA

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

IR

IR

IS

DNA nhiễm sắc thể

vị trí mục tiêu

chèn vào

cắt

cắt

IR

IR

IS chèn vào

DNA polymerase và DNA ligase sửa chữa khoảng trống

Chuỗi nucleotide lặp lại trực tiếp

(direct repeat) ở vị trí IS được chèn vào

IS

IS

2,5~10kb kkkkkkbkb

Gen kháng lại kháng ssinhsinh

Gen kháng kháng sinh sinhsinh

Transposase

Resolvase

ITR

ITR

~5kb kkkkkkkkkb

DNA vi khuẩn (~50 bp)

Mu DNA vi khuẩn

(38 kb)

DNA vi khuẩn (~1000bp )

genome E. coli

genome E. coli

Ghép vào genometế bào chủ loại bỏ DNA vi khuẩn

Các bản sao Mu di chuyển và ghép vào genome vi khuẩn

Đóng gói Mu trong thể phage mới

Genome người 3000 Mb

Gen và trình tự liên quan đến gen 900 Mb

DNA mã hóa 90 Mb

DNA không mã hóa 810Mb

DNA lặp lại 420 Mb

Trình tự lặp lại duy nhất và có bản sao thấp

1680 Mb

Trình tự DNA giữa các gen 2100Mb

Pseudo-Gene

Các đoạn gen

Intron và leader, trailer

DNA lặp lại liền kề

DNA lặp lại phân bố rải rác

DNA satellite

Micro-satellite

LTRs

SINEs

mini-satellite

LINEs

DNA transposon

Bảng 5 - 1. Các protein và gen liên quan đến tái bản DNA ở E.coli

Hình 5 - 10. Sơ đồ trình bày cơ chế sửa chữa DNA bằng tái tổ hợp sau tái bản do tia UV gây nên.

a) Đoạn phân tử DNA chứa 2 thymine liền kề;

b) Hình thành nên thymine dimer khi bị chiếu UV;

c) Khi tái bản đoạn DNA chứa thymine dimer tạo thành một sợi đơn mới mất những bazơ tại nơi đối xứng vì tại vị trí dimer đã mất khả năng làm nguyên bản cho enzyme DNA polymerase và enzyme này nhảy qua chỗ đó và tiếp tục tổng hợp;

d) Tái tổ hợp xảy ra giữa hai nhiễm sắc thể chị em tạo nên một sợi DNA không bị hỏng và một sợi hỏng, sợi hỏng này sẽ không tồn tại.

Hình IV.6

TyB

( 340np

TyA

( 340np

=5900np

5’-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTT -3’

3’-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAA-5’

5’-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUU -3’

Hình thành cấu trúc kẹp tóc

U

A

U

A

G

A

G

C

G

C

G

C

G

C

G

C

G

C

C

5’-CCCA UUUUUUU -3’

mRNA

DNA đoạn terminator

Đơn vị chủ quản: CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI ĐIỆN TỬ THIÊN THI
Địa chỉ: 41-43 Trần Cao Văn, P6, Q3, HCM
giấy phép MXH: 102/GXN - TTĐT